范子彥，師默聞，劉珊珊，李中皓，李 倩，鄧惠敏，楊 飛，王 穎，邊照陽，唐綱嶺*

1.國家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2號 450001

2.河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，鄭州市經(jīng)開區(qū)第三大街8號 450000

致病微生物引發(fā)的食源性安全風(fēng)險引起了社會各界的廣泛關(guān)注，對食品、藥品、卷煙等產(chǎn)品包裝中微生物的檢測成為研究熱點(diǎn)［1］。平板計(jì)數(shù)法［2］、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法（PCR法）［3］、熒光光電法［4］和流式細(xì)胞術(shù)［5］等方法逐步發(fā)展起來。平板計(jì)數(shù)法技術(shù)準(zhǔn)確、可靠，但需要增菌培養(yǎng)，檢測周期長；PCR法靈敏度高，檢測速度快，但是對人員要求高；流式細(xì)胞術(shù)儀器昂貴，檢測靈敏度較低［2-5］。傳統(tǒng)培養(yǎng)理論認(rèn)為，微生物生長過程中會大量分泌CO2氣體，從而導(dǎo)致培養(yǎng)基中pH發(fā)生變化，熒光光電法將這種pH變化轉(zhuǎn)化為可讀取的熒光信號，替代傳統(tǒng)的肉眼或者顯微鏡觀察，大大提高了微生物的檢測靈敏度［6-8］。

典型的熒光光電微生物傳感器使用玻璃纖維將pH敏感型熒光染料包裹，通過檢測熒光信號的變化實(shí)現(xiàn)對微生物的檢測［4,9］。傳感器需要對玻璃纖維進(jìn)行化學(xué)修飾來保證透光性和熒光染料不泄露，造成傳感器構(gòu)建成本高昂和不穩(wěn)定。為了克服這一缺點(diǎn)，將pH敏感型熒光染料共價固定在納米膠束表面，與熱瓊脂溶液混合后制備熒光傳感凝膠，傳感凝膠通過響應(yīng)大腸桿菌生長過程中pH的變化實(shí)現(xiàn)對大腸桿菌的快速檢測［10-12］。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

0.22 μm水相濾膜、Slide-A-LyzerTM微量透析管（美國Thermo Fisher Scientific公司）；滅菌袋（南京便診公司）；大腸桿菌（山東大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院提供）；煙用紙張（國家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心提供）。

氨基修飾的磷脂聚乙二醇（DSPE-PEG2000-NH2，98%，西安瑞禧生物科技有限公司）；異硫氰酸熒光素（Fluorescein isothiocyanate,FITC）、二甲亞砜、瓊脂、胰蛋白胨、氯化鈉、乳糖、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、月桂基硫酸鈉、氫氧化鈉（AR，美國Sigma公司）；生理鹽水（南京便診公司）。

CP2245電子分析天平（感量0.000 1 g，德國Satorious公司）；Mastersizer 3000動態(tài)光散射粒度分析儀（英國Malvern公司）；FluoroMax-4穩(wěn)態(tài)分子熒光儀（日本Horiba公司）；Biolumix-32微生物實(shí)時熒光光電系統(tǒng)（美國Biolumix公司）；E-Gel Imager凝膠成像系統(tǒng)，超凈工作臺（美國Thermo公司）；JY92-IIN細(xì)胞破碎儀（寧波新芝公司）；ZWY-2102C空氣浴搖床（上海智城公司）；Milli-Q超純水純化系統(tǒng)（美國Millipore公司）；微生物傳感器容器（美國Biolumix公司）；Merlin掃描電子顯微鏡（德國Zeiss公司）。

1.2 方法

1.2.1 pH敏感型熒光納米傳感器構(gòu)建

使用異硫氰酸熒光素標(biāo)記氨基修飾的磷脂聚乙二醇制備具有兩親性的DSPE-PEG-FITC聚合物分子，DSPE-PEG-FITC滴入水相溶液中自組裝成納米膠束，與熱瓊脂溶液混合，冷卻后制備pH敏感型納米傳感凝膠，裝入測試管中構(gòu)建pH敏感型熒光納米傳感器，如圖1所示。

圖1 pH敏感型熒光納米傳感器構(gòu)建示意圖Fig.1 Schematic diagram of fluorescent pH-sensitive nano-micelle biosensors

1.2.2 pH敏感型熒光納米膠束的制備與表征

取20 mg DSPE-PEG2000-NH2溶于1 mL DMSO中；完全溶解后，加入4 mg FITC，避光條件下加熱至90℃，攪拌反應(yīng)2 h；冷卻至室溫，利用微量透析管在純水中透析2 d，冷凍干燥制備DSPEPEG-FITC［13］。

將DSPE-PEG-FITC復(fù)溶至1 mL DMSO中，制備成10 mg/mL的納米膠束溶液。取10 μL該溶液，逐滴加至2 mL濃度為20 mmol/L、pH為7.4的磷酸鹽緩沖溶液（Phosphate buffer saline，PBS）中，至膠束濃度為50 mg/L。使用30%功率的超聲波在兩種條件下（分別為連續(xù)超聲1 min和開5 s、關(guān)5 s的間歇超聲1 min）對納米膠束溶液進(jìn)行超聲分散，使用0.22 μm水相濾膜過濾膠束溶液后，使用動態(tài)光散射法對納米膠束的粒徑進(jìn)行表征。

配制pH 4.5～9.0的磷酸緩沖溶液，添加熒光納米膠束至終濃度為50 mg/L，使用分子熒光儀觀察不同pH條件下熒光納米膠束的熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長480 nm，發(fā)射波長520 nm。

1.2.3 pH敏感型熒光納米膠束傳感器的構(gòu)建

參照GB 4789.3—2016［2］的方法配制月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（Lauryl tryptose broth,LST）肉湯，并進(jìn)行一定修改。在950 mL去離子水中加入20 g胰蛋白胨，5 g氯化鈉，5 g乳糖，2.75 g磷酸氫二鉀，2.75 g磷酸二氫鉀，0.1 g月桂基硫酸鈉，混勻至完全溶解；用5 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7.4；用去離子水定容至1 L；在1.05 kg/cm2（15 psi）高壓下蒸汽滅菌20 min。

取400 mg瓊脂溶于純水中，煮至沸騰，即制得2%的熱瓊脂溶液。瓊脂溶液冷卻至70℃后，加入熒光納米膠束顆粒至終濃度50 mg/L，震蕩混勻后置入微生物傳感器容器底部，使用0.22 μm水相濾膜將傳感凝膠和液體培養(yǎng)基分離。納米膠束凝膠冷卻后，使用凝膠成像系統(tǒng)觀察瓊脂對熒光信號響應(yīng)的影響。

1.2.4 煙用紙張樣品中大腸桿菌的快速檢測

在無菌環(huán)境下，稱取25 g煙用紙張，裁剪成1～2 cm2的紙張碎片，裝入含有0.85%無菌生理鹽水的225 mL滅菌袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打2～4 min，混合均勻，取1 mL加入到熒光傳感器測試管中，使用實(shí)時快速微生物光電系統(tǒng)測試樣品，實(shí)時快速微生物系統(tǒng)參數(shù)如表1所示。將剩余樣品混合均勻，密封后36℃下過夜培養(yǎng)，用于增菌檢測。

表1 實(shí)時快速微生物檢測系統(tǒng)參數(shù)Tab.1 Parameters of real-time quick microorganism detection system

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光納米膠束的制備表征

2.1.1 納米膠束的熒光標(biāo)記

使用異硫氰酸熒光素（FITC）對納米膠束單體（氨基修飾的磷脂聚乙二醇，DSPE-PEG2000-NH2）上的氨基進(jìn)行共價偶聯(lián)。FITC最大吸收波長為480～495 nm，最大發(fā)射波長為520～530 nm，可呈現(xiàn)出明亮黃綠色熒光，其含有的異硫氰基在堿性（pH 9.0～9.5）條件下，可以與納米膠束單體上親水端的氨基結(jié)合而實(shí)現(xiàn)熒光標(biāo)記。標(biāo)記有熒光素的納米膠束單體在水相溶液中可以自組裝成納米膠束，其中磷脂提供疏水核心，PEG-FITC提供親水端，暴露在水相中的熒光素具有隨pH升高熒光強(qiáng)度增加的特點(diǎn)，從而實(shí)現(xiàn)溶液中pH變化的監(jiān)控［14-15］。將制備好的標(biāo)記有FITC的納米膠束單體溶于pH為8.0的20 mmol/L磷酸的磷酸緩沖溶液中，納米膠束的分散濃度為50 mg/L，使用480 nm激發(fā)，520 nm發(fā)射檢測納米膠束溶液，結(jié)果如圖2所示。實(shí)線是標(biāo)記FITC的納米膠束，虛線是未標(biāo)記的納米膠束，標(biāo)記FITC后熒光信號大幅提升，表明標(biāo)記成功。

圖2 納米膠束熒光標(biāo)記表征結(jié)果Fig.2 Fluorescence characterization of FITC labeled DSPE-PEG2000 nano-micelles

2.1.2 納米膠束的粒徑表征

傳感器設(shè)計(jì)使用0.22 μm的水相濾膜對傳感凝膠和培養(yǎng)基進(jìn)行分離，小于220 nm的顆粒會向培養(yǎng)基中擴(kuò)散，而顆粒粒徑過大會導(dǎo)致在傳感凝膠中分散不均勻，因此需要對納米膠束的粒徑進(jìn)行控制。納米膠束單體通過自組裝在水相體系中形成納米膠束顆粒，粒徑的大小受到納米膠束單體添加濃度和超聲分散時間的影響。因此，使用動態(tài)光散射粒度分析儀（粒度儀）考察了25和50 mg/L兩個納米膠束單體濃度條件下，兩種不同超聲條件下納米膠束粒徑的分布，結(jié)果如圖3所示。納米膠束的粒徑隨納米膠束單體濃度的增加而變大，溫和的間歇超聲條件下納米膠束粒徑大于連續(xù)超聲模式。為了避免連續(xù)超聲對納米膠束穩(wěn)定性的影響，選擇50 mg/L的納米膠束單體濃度和間歇超聲作為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)條件，在該條件下納米膠束的粒徑范圍是295～458 nm。

圖3 不同納米膠束單體添加濃度和超聲條件下納米膠束顆粒的分布（動態(tài)光散射表征）Fig.3 DLS characterization of pH-sensitive nano-micelles under different concentrations and ultrasonic conditions

為了進(jìn)一步表征實(shí)驗(yàn)條件下納米膠束的粒徑分布，使用掃描電子顯微鏡對納米膠束粒徑進(jìn)行表征，結(jié)果如圖4所示。結(jié)果表明納米膠束的粒徑在300～500 nm之間。這一結(jié)果與動態(tài)光散射的表征結(jié)果一致。

圖4 納米膠束的原子力顯微鏡表征Fig.4 Atomic force microscope characterization of pH-sensitive nano-micelles

2.2 熒光納米膠束的pH響應(yīng)

納米膠束單體上親水端共價偶聯(lián)了FITC，在納米膠束的自組裝過程中，磷脂形成疏水核心，PEG-FITC具有親水性而暴露在納米膠束外部。熒光染料FITC對pH敏感，圖5a為不同pH條件下熒光納米膠束的熒光強(qiáng)度。可知，當(dāng)pH從4.5升高到9.0時，納米膠束的熒光信號快速增強(qiáng)，表明所制備的納米膠束可以響應(yīng)分散體系中pH的變化。為了進(jìn)一步考察納米膠束在瓊脂糖凝膠中的熒光性能，添加納米膠束單體到70℃瓊脂糖凝膠溶液中制備納米膠束凝膠，并浸泡在不同pH的緩沖溶液中，如圖5b所示。結(jié)果表明，納米膠束在凝膠狀態(tài)下也可以響應(yīng)體系pH的變化。實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，離心管上清液中的熒光信號很低，表明瓊脂凝膠對納米膠束的固定較好，沒有發(fā)生納米膠束的泄露。

圖5 不同pH緩沖溶液中納米膠束（a）及其凝膠（b）熒光強(qiáng)度的響應(yīng)Fig.5 Fluorescence intensity response of pH-sensitive nano-micelle(a)and gel（b）in buffers of different pH

2.3 煙用紙張中大腸桿菌的檢測

根據(jù)傳統(tǒng)培養(yǎng)理論，大腸桿菌在生長代謝過程中，會產(chǎn)酸產(chǎn)氣，導(dǎo)致培養(yǎng)基溶液pH下降，這為實(shí)時檢測大腸桿菌的生長提供了理論依據(jù)。按照圖1的設(shè)計(jì)，構(gòu)建了pH敏感型微生物納米膠束傳感器，選取一組大腸桿菌平板法檢測陽性的煙用紙張進(jìn)行直接檢測和增菌培養(yǎng)后檢測，結(jié)果如圖6所示。傳感器的熒光信號值隨著培養(yǎng)時間的增加而降低，增菌培養(yǎng)后的檢出時間為2.6 h，直接檢測的檢出時間為9.1 h，而陰性紙張?jiān)?2.0 h的檢測窗口未有大腸桿菌檢出，表明構(gòu)建的納米膠束傳感器可用于煙用紙張的直接、快速檢測。同時，使用標(biāo)準(zhǔn)菌株對比快速檢測方法和平板計(jì)數(shù)方法的差異，使用平板計(jì)數(shù)的大腸桿菌的測試結(jié)果校準(zhǔn)快速檢測方法的檢出時間，并使用檢出時間評估大腸桿菌數(shù)量，結(jié)果如圖7所示?？芍?，微生物初始數(shù)量越多檢測時間越短。結(jié)果表明，生物傳感器可用于煙用紙張中大腸桿菌水平的簡單評估。

圖6 大腸桿菌生長過程中生物傳感器的熒光信號響應(yīng)Fig.6 Fluorescence intensity response of biosensors during microorganism growing

圖7 煙用紙張大腸桿菌數(shù)量與檢測時間的相關(guān)性Fig.7 Correlation between sum of Escherichia coli in cigarette paper and detection time

3 結(jié)論

①基于傳統(tǒng)培養(yǎng)理論和pH敏感型熒光納米膠束的制備，成功構(gòu)建了熒光納米膠束傳感器；②以磷脂為疏水核心，PEG-FITC為親水端，通過自組裝方式制備了熒光納米膠束，使用動態(tài)光散射和原子力顯微鏡表征的優(yōu)化條件下制備的納米膠束粒徑在300～500 nm之間；③熒光光譜的數(shù)據(jù)表明，熒光納米膠束及其凝膠激發(fā)和發(fā)射波長分別在480和520 nm；在pH 4.5～9.0之間，隨著pH的升高，熒光信號增加，可以快速響應(yīng)微生物生長過程中pH的變化；④實(shí)際樣品分析表明，pH敏感型熒光納米膠束傳感器可以用于煙用紙張中大腸桿菌的直接檢測，檢測時間相比傳統(tǒng)平板計(jì)數(shù)法大幅縮短，并可用來快速評估煙用紙張樣品中大腸桿菌的數(shù)量。