程建軍，徐 麗，歐才智，郭蓮東，張高鵬，倪春蕾，丁陽月，江連洲

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優(yōu)化催芽溫度及CaCl2溶液濃度提高發(fā)芽小米中-氨基丁酸含量

程建軍，徐 麗，歐才智，郭蓮東，張高鵬，倪春蕾，丁陽月，江連洲※

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱 150030）

-氨基丁酸（-amino butyric acid，GABA）是一種非蛋白質(zhì)氨基酸，具有多種生理活性。為進(jìn)一步提升富含GABA食品的市場(chǎng)占有率，以小米為原料，通過發(fā)芽處理提高小米的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，提高GABA的含量。為提高發(fā)芽小米中GABA的含量，通過單因素試驗(yàn)、Plackett-Burman因素篩選試驗(yàn)、最陡爬坡試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)，優(yōu)化發(fā)芽條件提高小米中GABA含量。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，經(jīng)過Plackett-Burman設(shè)計(jì)篩選出對(duì)GABA含量影響顯著的3個(gè)因素：浸泡時(shí)間、CaCl2溶液濃度和發(fā)芽溫度。經(jīng)最陡爬坡試驗(yàn)，確定對(duì)GABA含量影響顯著的三因素在響應(yīng)面中心點(diǎn)水平：浸泡時(shí)間13 h、CaCl2溶液濃度3.5 mmol/L和發(fā)芽溫度31 ℃。經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)得出發(fā)芽小米積累GABA的最優(yōu)工藝條件為：浸泡時(shí)間13 h、浸泡溫度35 ℃、CaCl2溶液濃度3.5 mmol/L、發(fā)芽時(shí)間48 h和發(fā)芽溫度31 ℃，此時(shí)制得的發(fā)芽小米中GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為251.46 mg/100 g，比小米中的初始GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)86.72 mg/100 g提高了2.90倍。研究結(jié)果得到了最佳小米發(fā)芽條件，為富含GABA健康小米食品的制備提供理論支持。

農(nóng)產(chǎn)品；品質(zhì)控制；氨基酸；小米；發(fā)芽；-氨基丁酸；Plackett-Burman試驗(yàn)

0 引 言

小米，禾本科狗尾草屬草本植物，具有生育期短、抗干旱和耐貧瘠等優(yōu)點(diǎn)，是北方地區(qū)廣泛種植的一種小雜糧[1]。小米具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，含有人體必需的多種礦物質(zhì)，以及適合人體吸收的多種營(yíng)養(yǎng)素，是理想的營(yíng)養(yǎng)來源[2]。明代李時(shí)珍《本草綱目》記載:“粟米氣味咸，微寒無毒，主治養(yǎng)賢氣，去脾胃中熱。益氣，陳者苦寒，治胃熱消渴，利小便”[3]。-氨基丁酸（-amino butyric acid，GABA）是廣泛分布于動(dòng)物和植物中的非蛋白質(zhì)氨基酸，是存在于哺乳動(dòng)物腦、脊髓中的抑制性神經(jīng)傳遞物質(zhì)，在人或動(dòng)物體內(nèi)參與腦循環(huán)生理活動(dòng)[4]。GABA是一種生物活性物質(zhì)，有降血壓、調(diào)節(jié)心血管和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)、活化肝腎功能、防止動(dòng)脈硬化等功能，能夠增強(qiáng)食品風(fēng)味[5-7]。

發(fā)芽處理被認(rèn)為是一種方便且有效的改善谷物食用品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的方法。其成本低廉，可以有效提高谷物的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和生物活性成分含量，提升GABA的含量。在發(fā)芽期間，內(nèi)源種子酶被活化，一些儲(chǔ)備化合物如蛋白質(zhì)和碳水化合物被水解成小分子，而生成新的細(xì)胞成分和植物化學(xué)化合物[8]。幾乎所有的谷類種子，如大米、玉米、小米、蕎麥等，都可用于發(fā)芽。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，發(fā)芽時(shí)，植物GABA通過GABA支路和多胺代謝2種途徑，使L-谷氨酸在谷氨酸脫羧酶催化下脫羧生成GABA，同時(shí)，在內(nèi)源蛋白酶等多種酶的作用下，多胺降解生成GABA。GABA又在GABA轉(zhuǎn)氨酶的催化下形成琥珀酸半醛，GABA的合成是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過程，不同的發(fā)芽條件都會(huì)影響GABA的含量[9-15]。有研究表明，通過響應(yīng)面方法優(yōu)化發(fā)芽條件可提高谷物中GABA含量，例如發(fā)芽糙米中的GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到232.8 mg/100 g[16]；發(fā)芽黑玉米中的GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)從15.27提升至53.17 mg/100 g[8]；發(fā)芽虹豆、蕎麥的GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到203.53和 127.96 mg/100 g[5,17]；發(fā)芽小米中GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別從6.36和9.36提升至35.70和47.43 mg/100 g[18-19]。

為了進(jìn)一步提高發(fā)芽小米中GABA含量，采用多試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化小米發(fā)芽條件。本研究通過Plackett-Burman設(shè)計(jì)，從浸泡時(shí)間、浸泡溫度、CaCl2溶液濃度（下面簡(jiǎn)稱：CaCl2濃度）、發(fā)芽時(shí)間和發(fā)芽溫度因素中篩選出對(duì)發(fā)芽小米中GABA含量有顯著影響的因素，避免在后期的優(yōu)化試驗(yàn)中由于因素太多或部分因素不顯著而浪費(fèi)資源。然后，采用最陡爬坡試驗(yàn)快速逼近最優(yōu)值，確定顯著因素的最佳區(qū)域；最后用響應(yīng)面法對(duì)小米發(fā)芽工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，以GABA生成量為響應(yīng)值，得到富集GABA的最佳小米發(fā)芽工藝條件，為富含GABA健康小米食品的制備提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小米（龍谷38號(hào)，GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)：（86.72±2.10）mg/ 100 g）來自黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院；硼酸（天津市天力化學(xué)試劑有限公司）；四硼酸鈉（天津市天力化學(xué)試劑有限公司）；苯酚（北京索萊寶科技有限公司）；次氯酸鈉（天津市天力化學(xué)試劑有限公司）；乙醇（天津市天力化學(xué)試劑有限公司）；氯化鈣（天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠）。

1.2 儀器與設(shè)備

LHS-100CL型恒溫恒濕箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），HZQ-F100型振蕩培養(yǎng)箱（哈爾濱市東聯(lián)生化儀器有限公司），UVmini-1240型分光光度計(jì)（島津儀器（蘇州）有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 小米發(fā)芽工藝流程

流程為：小米→除雜→沖洗→浸泡→發(fā)芽→干燥→保存。

操作要點(diǎn)[18-19]：浸泡：將小米與含有不同濃度CaCl2的浸泡液以1∶10（質(zhì)量體積比）比例混合；發(fā)芽：將小米均勻攤放于底部墊有濾紙的平皿內(nèi)，蓋上6層紗布，按試驗(yàn)要求控制發(fā)芽時(shí)間（1260 h）和發(fā)芽溫度（2040 ℃）；干燥：將發(fā)芽小米于45 ℃下干燥8 h，使最終小米含水率達(dá)到7%8%；保存：置于18 ℃條件下保存待測(cè)。

1.3.2 浸泡和發(fā)芽條件對(duì)發(fā)芽小米中GABA含量的影響

1）不同浸泡時(shí)間對(duì)發(fā)芽小米中GABA含量的影響

按上述1.3.1的操作方法，分別在浸泡時(shí)間4、8、12、16、20 h，浸泡溫度30 ℃，不添加CaCl2，發(fā)芽時(shí)間48 h，發(fā)芽溫度25 ℃條件下，比較不同浸泡時(shí)間對(duì)發(fā)芽小米中GABA含量的影響。

2）不同浸泡溫度對(duì)發(fā)芽小米中GABA含量的影響

按1.3.1的操作方法，分別在浸泡時(shí)間12 h，浸泡溫度25、30、35、40、45 ℃，不添加CaCl2，發(fā)芽時(shí)間48 h，發(fā)芽溫度25 ℃條件下，比較不同浸泡溫度對(duì)發(fā)芽小米中GABA含量的影響。

3）不同CaCl2濃度對(duì)發(fā)芽小米中GABA含量的影響

按1.3.1的操作方法，分別在浸泡時(shí)間12 h，浸泡溫度30 ℃，CaCl2濃度0、1、2、3、4 mmol/L，發(fā)芽時(shí)間48 h，發(fā)芽溫度25 ℃條件下，比較不同浸泡時(shí)間對(duì)發(fā)芽小米中GABA含量的影響。

4）不同發(fā)芽時(shí)間對(duì)發(fā)芽小米中GABA含量的影響

按1.3.1的操作方法，分別在浸泡時(shí)間12 h，浸泡溫度30 ℃，不添加CaCl2，發(fā)芽時(shí)間12、24、36、48、60 h，發(fā)芽溫度25 ℃條件下，比較不同發(fā)芽時(shí)間對(duì)發(fā)芽小米中GABA含量的影響。

5）不同發(fā)芽溫度對(duì)發(fā)芽小米中GABA含量的影響

按1.3.1的操作方法，分別在浸泡時(shí)間12 h，浸泡溫度30 ℃，不添加CaCl2，發(fā)芽時(shí)間48 h，發(fā)芽溫度20、25、30、35、40 ℃條件下，比較不同發(fā)芽溫度對(duì)發(fā)芽小米中GABA含量的影響。

1.3.3 Plackett-Burman因素篩選試驗(yàn)

依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，每個(gè)因子的最佳水平被定義為“基礎(chǔ)限值”，將“基礎(chǔ)限值”在次優(yōu)水平方向乘以或除以1.5獲得另一個(gè)限值，該限值和基礎(chǔ)限值作為Plackett-Burman試驗(yàn)中的“＋1”和“－1”水平，選用11因素、12次試驗(yàn)的Plackett-Burman表，實(shí)際考察5個(gè)因素的影響顯著[20]。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，將各自變量按其取值范圍進(jìn)行編碼，Plackett-Burman因素篩選試驗(yàn)因素水平編碼如表1所示。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)因素水平編碼表

1.3.4 最陡爬坡試驗(yàn)

經(jīng)Plackett-Burman試驗(yàn)篩選的顯著因素，按其與指標(biāo)相關(guān)性，正相關(guān)因子逐漸增加單因素試驗(yàn)結(jié)果中最佳水平的值，負(fù)相關(guān)因子逐漸減少最佳水平值，從而形成最陡爬坡試驗(yàn)表。根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)篩選出的因素顯著性大小設(shè)定各取值之間的間距即水平變化的“步長(zhǎng)”。完成爬坡試驗(yàn)并取得結(jié)果后，選擇具有最高GABA含量的試驗(yàn)處理，并將相應(yīng)的處理因子值用作Box-Behnken優(yōu)化試驗(yàn)中的“0水平”。

1.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，按照爬坡試驗(yàn)確定的Box-Behnken試驗(yàn)各因素的“0水平”，再選擇涵蓋次優(yōu)水平的步長(zhǎng)，從零水平數(shù)值計(jì)算得到“1”和“1”水平。以GABA作為響應(yīng)值，運(yùn)用Design-Expert 8.0.6.1進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)發(fā)芽生產(chǎn)高GABA小米進(jìn)行工藝優(yōu)化。

1.3.6 GABA測(cè)定

稱取粉碎過的發(fā)芽小米粉1.00 g，用蒸餾水定容到10 mL后，振蕩提取2 h，過濾后再過0.22m的濾膜。取濾液1 mL，加入pH 值9.0的硼酸緩沖液1 mL，5%的重蒸酚溶液2 mL，有效氯為7%的次氯酸鈉1 mL，充分振蕩混勻；沸水浴10 min，然后冰浴20 min，直至有藍(lán)綠色化合物出現(xiàn)，再加入60%乙醇2 mL，于640 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度[21-23]。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得回歸方程為= 0.006 9+ 0.008 3，2 = 0.999 2。通過GABA標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對(duì)應(yīng)吸光值算出標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算GABA的含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每組試驗(yàn)重復(fù)3次，試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析采用Design expert 8.0.6.1、Minitab 17、Microsoft Excel 2007、SPSS16.0分析軟件，OriginPro 2017繪圖軟件。采用Tukey HSD 方法進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 浸泡和發(fā)芽條件對(duì)發(fā)芽小米中GABA含量的影響

2.1.1 浸泡時(shí)間、浸泡溫度和CaCl2濃度對(duì)發(fā)芽小米中GABA含量的影響

由圖1a中可以看出，發(fā)芽小米中GABA的含量隨著浸泡時(shí)間的延長(zhǎng)而呈現(xiàn)先上升后下降再上升的趨勢(shì)，在浸泡12 h時(shí)，小米中的GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到最高值（145.22±1.09）mg/100 g。在浸泡4、8 h時(shí)，發(fā)芽小米中GABA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)與未發(fā)芽小米的GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)（86.72±2.10）mg/100 g無顯著性差異（>0.05），這是因?yàn)?，在浸泡初期，在濕度梯度推?dòng)下，小米開始吸水，是物理吸漲過程，因此對(duì)GABA含量的影響不顯著。浸泡中期，胚乳中的干物質(zhì)通過酶的作用轉(zhuǎn)化為可溶性物質(zhì)，供給胚乳呼吸、發(fā)芽所需的營(yíng)養(yǎng)，為GABA的生成奠定了基礎(chǔ)，所以發(fā)芽小米中的GABA含量上升。但當(dāng)浸泡時(shí)間過長(zhǎng)時(shí)，細(xì)胞結(jié)構(gòu)受到損害，大量水溶性物質(zhì)溶出，生成GABA的底物含量減少，所以發(fā)芽小米中的GABA含量下降[24-25]。當(dāng)浸泡時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng)時(shí)，GABA含量又開始升高，這可能是因?yàn)?，此時(shí)的小米已經(jīng)結(jié)束了休眠，開始萌芽過程，這相當(dāng)于增加了發(fā)芽時(shí)間，從而使GABA含量升高。

注：不同字母表示發(fā)芽小米中GABA存在顯著性差異（P < 0.05）下同。

由圖1b中可以看出，發(fā)芽小米中GABA的含量隨著浸泡溫度的升高而呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在浸泡溫度為35 ℃時(shí)，小米中的GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到最高值（156.72±1.27）mg/100 g。這是因?yàn)榻轀囟仍礁?，小米吸水速度越快，胚乳中大分子物質(zhì)在酶的作用下分解為小分子物質(zhì)，為下一步GABA的生成奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)[13]。當(dāng)浸泡溫度過高時(shí)，發(fā)芽小米中GABA含量反而呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)，這可能是因?yàn)榻葸^程中，隨著溫度升高，吸脹越快，吸水飽和后，對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞更加嚴(yán)重，從而導(dǎo)致生成GABA的底物的溶出[24-25]。

由圖1c中可以看出，當(dāng)CaCl2濃度為0和1 mmol/L時(shí)，發(fā)芽小米中GABA含量并沒有顯著性差異（> 0.05），在CaCl2濃度為3 mmol/L時(shí)，小米中的GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到最高值（190.77±3.56）mg/100 g，顯著高于圖1a、圖1b、圖2a和圖2b中發(fā)芽小米中GABA含量最高值，盡管隨著濃度的進(jìn)一步增加，發(fā)芽小米中GABA的含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，但發(fā)芽小米中GABA的含量依舊處在較高水平。這是因?yàn)樵诮菀褐刑砑右欢舛鹊腃a2+促進(jìn)了GABA的產(chǎn)生，主要是因?yàn)镃a2+能活化谷氨酸脫羧酶，刺激酶活性，從而促進(jìn)谷氨酸轉(zhuǎn)化為GABA，達(dá)到增加GABA含量的目的[26]。

2.1.2 發(fā)芽時(shí)間和發(fā)芽溫度對(duì)發(fā)芽小米中GABA含量的影響

由圖2a中可以看出，發(fā)芽時(shí)間為12、24、36 h時(shí)，發(fā)芽小米中GABA的含量無顯著性變化，但相比小米未發(fā)芽時(shí)的GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)（86.72±2.10）mg/100 g，均有顯著性升高（< 0.05）。在發(fā)芽時(shí)間48 h時(shí)，小米中的GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到最高值（149.03±3.10）mg/100 g，在發(fā)芽時(shí)間60 h時(shí)，小米中的GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)（143.96±1.69）mg/100 g，GABA含量呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，但和發(fā)芽48 h小米中GABA含量相比無顯著性變化（0.05）。這是因?yàn)?，發(fā)芽處理會(huì)激活谷氨酸脫羧酶的活性，進(jìn)而催化小米中原有的谷氨酸脫羧生成GABA，從而使GABA含量升高，同時(shí)，小米中的蛋白質(zhì)在蛋白酶的水解作用下，進(jìn)一步生成谷氨酸，為谷氨酸脫羧酶提供充足的底物，使GABA含量升高。但隨著發(fā)芽時(shí)間的增加，發(fā)芽小米中GABA的含量持續(xù)升高，刺激了GABA轉(zhuǎn)氨酶的活性，從而將GABA轉(zhuǎn)化為琥珀酸半醛，導(dǎo)致GABA和消耗速率大于生成速率，所以在發(fā)芽后期GABA的含量呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)[27-29]。

由圖2b中可以看出，發(fā)芽小米中GABA的含量隨著發(fā)芽溫度而呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在發(fā)芽溫度為35 ℃時(shí)，小米中的GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到最高值（152.46±2.85）mg/100 g，發(fā)芽溫度30、35 ℃并沒有顯著性差異（> 0.05）。這是因?yàn)?，發(fā)芽溫度太低或者太高都會(huì)抑制谷氨酸脫羧酶的活性，進(jìn)而抑制谷氨酸脫羧產(chǎn)生GABA這一過程，從而造成GABA含量下降[30]。

2.2 Plackett-Burman因素篩選試驗(yàn)

Plackett-Burman因素篩選試驗(yàn)結(jié)果如表2所示，各因素顯著性排序如圖3所示，發(fā)芽溫度、浸泡時(shí)間、CaCl2濃度為顯著性最前的3位，而值分析在0.95的置信水平上，前3個(gè)因素具有顯著性，因此，選擇這3個(gè)因素進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)。

注：不同字母表示發(fā)芽小米中GABA存在顯著性差異（P < 0.05）。

表2 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果

圖3 Plackett-Burman試驗(yàn)的Pareto圖

2.3 Box-Behnken試驗(yàn)水平確立

根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選出的3個(gè)影響顯著的因素：發(fā)芽溫度、浸泡時(shí)間、CaCl2濃度，利用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果模擬5個(gè)因素對(duì)GABA含量的一階線性模型，方程如下

GABA = 175.8 – 7.11– 0.680+

16.85– 0.365+ 3.894（1）

根據(jù)該模型指導(dǎo)3個(gè)主效因素的步長(zhǎng)和爬坡方向，浸泡時(shí)間對(duì)于指標(biāo)表現(xiàn)出負(fù)相關(guān)性，CaCl2濃度和發(fā)芽溫度對(duì)于指標(biāo)都表現(xiàn)出正相關(guān)性。其中，浸泡時(shí)間、CaCl2濃度和發(fā)芽溫度的顯著效應(yīng)值分別為7.11、16.85和3.89，結(jié)合Plackett-Burman試驗(yàn)中浸泡時(shí)間、CaCl2濃度和發(fā)芽溫度的步長(zhǎng)分別為3、0.5和6，從單因素試驗(yàn)結(jié)果中最優(yōu)水平開始，采用0.1倍步長(zhǎng)增大/減少試驗(yàn)處理水平，計(jì)算采用2.133、0.842 5和2.336 4倍步長(zhǎng)，實(shí)際采用2、1和2倍步長(zhǎng)增大試驗(yàn)處理水平。顯著因素最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果見表3[31-32]。

表3 最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果

由表3可知，第2組試驗(yàn)處理得到的GABA含量最多，所以選擇第2組試驗(yàn)方案即浸泡時(shí)間13 h、CaCl2濃度為3.5 mmol/L和發(fā)芽溫度31 ℃作為Box-Behnken試驗(yàn)各因素的“0水平”。

2.4 發(fā)芽條件優(yōu)化

2.4.1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

對(duì)浸泡時(shí)間（）、CaCl2濃度（）和發(fā)芽溫度（）進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果如表4所示。

通過Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合分析，方程如下

GABA =2 918.5 + 56.181 8+ 127.129+ 165.2170.223 4+ 0.114 73+ 0.712 562.397 5221.85922.671 82（2）

2.4.2 回歸方程顯著性分析

為了考察模型的擬合度，尋找主效應(yīng)顯著性以及各因素之間的相互作用，并對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析，其結(jié)果如表5所示。

表4 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果

從表中可以看出，模型達(dá)到極顯著水平（< 0.01），失擬項(xiàng)= 0.4713不顯著（> 0.05），這表明所選模型合理。同時(shí)，模型的決定系數(shù)2= 0.998 3，校正決定系數(shù)2adj = 0.996 0，模型擬合程度良好，因此，可以用此模型分析和預(yù)測(cè)發(fā)芽條件對(duì)GABA含量的影響。通過值檢驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該模型一次項(xiàng)、、和二次項(xiàng)2、2、2的值小于0.000 1，對(duì)模型貢獻(xiàn)大，對(duì)GABA含量影響極顯著，而交互項(xiàng)的值小于0.05，表明其對(duì)GABA含量影響顯著。

2.4.3 響應(yīng)曲面交互作用分析

利用Design-Expert 8.0.6.1對(duì)表5和表6中的數(shù)據(jù)進(jìn)行交互作用分析，結(jié)果見圖4。

表5 響應(yīng)面試驗(yàn)二次回歸結(jié)果方差分析表

注：**表示差異極顯著（< 0.01）；*表示差異顯著（< 0.05）。

Note:**means extremely significant（< 0.01）;*means significant differences（< 0.05）.

圖4 交互作用對(duì)發(fā)芽小米GABA含量的影響

圖4直觀地反映了交互作用對(duì)發(fā)芽小米中GABA含量的影響。等高線的形狀能夠反映出交互作用的強(qiáng)弱，若接近橢圓形，則交互作用顯著；若接近圓形，則交互作用不顯著[5]。從響應(yīng)曲面形狀可反映各自變量之間的交互作用對(duì)發(fā)芽小米GABA含量的影響，曲面形狀越陡峭，對(duì)響應(yīng)值的影響則越顯著。通過比較發(fā)現(xiàn)，CaCl2濃度和發(fā)芽溫度對(duì)發(fā)芽小米GABA含量的交互作用最為顯著，浸泡時(shí)間和發(fā)芽溫度的交互作用次之，浸泡時(shí)間和CaCl2濃度的交互作用最弱。

整體上，隨著浸泡時(shí)間、CaCl2濃度和發(fā)芽溫度的上升，發(fā)芽小米GABA含量也隨之升高，但當(dāng)達(dá)到最高值后，各水平進(jìn)一步增加，發(fā)芽小米中GABA含量減少。從圖4a和圖4b中可以看到，浸泡時(shí)間為13 h附近時(shí)，發(fā)芽小米中GABA的含量達(dá)到最大值；從圖4b和圖4c中可以看到，CaCl2濃度3.5 mmol/L為發(fā)芽小米中GABA的含量達(dá)到最大值；從圖4a和圖4c中可以看到，發(fā)芽溫度32 ℃附近時(shí)為發(fā)芽小米中GABA的含量達(dá)到最大值[17]。

2.4.4 發(fā)芽小米積累GABA工藝條件的優(yōu)化

通過回歸模型預(yù)測(cè)小米發(fā)芽的最優(yōu)條工藝件是：浸泡時(shí)間12.32 h、CaCl2濃度為3.36 mmol/L和發(fā)芽溫度31.63 ℃，在此條件下發(fā)芽小米的GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)是254.19 mg/100 g?？紤]到試驗(yàn)的可操作性，小米發(fā)芽的工藝條件為：浸泡時(shí)間12.5 h、CaCl2濃度為3.4 mmol/L和發(fā)芽溫度31.5 ℃。

采用上述最優(yōu)發(fā)芽條件參數(shù)進(jìn)行3次驗(yàn)證，發(fā)芽小米GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的實(shí)際值是（249.47±1.23）mg/100 g，實(shí)際值與預(yù)測(cè)值之間的相對(duì)誤差為1.9%，發(fā)芽小米GABA含量的實(shí)際值與模型預(yù)測(cè)值較吻合，說明上述模型擬合度好，具有實(shí)際應(yīng)用性。可以良好的預(yù)測(cè)并優(yōu)化各發(fā)芽工藝參數(shù)對(duì)發(fā)芽小米GABA含量的影響。但是，該最優(yōu)方案實(shí)測(cè)值低于響應(yīng)面試驗(yàn)中心點(diǎn)實(shí)測(cè)值（251.46±1.93）mg/100 g，因此，為實(shí)際應(yīng)用方便，選擇浸泡時(shí)間13 h、CaCl2濃度為3.5 mmol/L和發(fā)芽溫度 31 ℃作為實(shí)際生產(chǎn)操作的最優(yōu)方案，該方案相比初始GAGB含量提高了2.9倍。

3 結(jié) 論

1）通過單因素試驗(yàn)和Plackett-Burman試驗(yàn)篩選出對(duì)GABA影響最顯著的3個(gè)因素：浸泡時(shí)間、CaCl2濃度和發(fā)芽溫度。

2）利用最陡爬坡試驗(yàn)逼近GABA含量最大的響應(yīng)值區(qū)域，確定響應(yīng)面試驗(yàn)的中心點(diǎn)為：浸泡時(shí)間13 h、浸泡溫度35 ℃、CaCl2濃度3.5 mmol/L、發(fā)芽時(shí)間48 h和發(fā)芽溫度31 ℃。

3）通過響應(yīng)面Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)得到浸泡時(shí)間、CaCl2濃度和發(fā)芽溫度的最優(yōu)水平。小米發(fā)芽的工藝條件為：浸泡時(shí)間13 h、浸泡溫度35 ℃、CaCl2濃度 3.5 mmol/L、發(fā)芽時(shí)間48 h和發(fā)芽溫度31 ℃。在該條件下，發(fā)芽小米中GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到（251.46±1.93）mg/100 g，較優(yōu)化前提高了2.90倍。

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Optimization of germination temperature and CaCl2concentration to improve-amino butyric acid content in germination millet

Cheng Jianjun, Xu Li, Ou Caizhi, Guo Liandong, Zhang Gaopeng, Ni Chunlei, Ding Yangyue, Jiang Lianzhou※

150030,

Millet is an ancient crop and used as a staple food grain in many semi-arid and tropical areas of the world due to its strong vitality in drought prone areas and very poor soils where other crops fail to grow. Because of its varieties essential nutrients for the human body, and suitable ratio of nutrients, millet has been considered extensively an ideal source of nutrition.-amino butyric acid, a non-protein amino acid with four-carbon components, has showed many health benefits. Germination is a biochemical process that can improve effectively the nutrients in whole grains. Especially, germination can increase the content of-amino butyric acid of cereals. The germinated millet is a potential source of functional food. To improve the content of the-amino butyric acid in germinated millet, the optimal technological conditions was performed through the single factor experiment, Plackett-Burman experiment, steepest ascent path experiment and response surface methodology. Through the Single factor experiment, the optimum level of each factor was soaking time of 12 h, soaking temperature of 35℃, CaCl2concentration of 3 mmol/L, germination time of 48 h and germination temperature of 35℃. On the base of the single factor experiment, soaking time, CaCl2concentration and germination temperature which affected significantly the content of the γ-amino butyric acid were selected through the Plackett-Burman experiment. By use of Minitab software, a first-order model was fitted to the date obtained from the experiment. The effects of the five factors: soaking time (), soaking temperature (), CaCl2concentration (), germination time () and germination temperature () were calculated to be GABA = 175.8 – 7.11– 0.680+16.85– 0.365+ 3.894. At the same time, the first-order linear model of all factors and the content of- amino butyric acid were formulated according to the results. Based on the formula and the three important effect factors above, the steepest ascent path experiment was carried out to determine the levels that affected significantly (<0.05) the content of- amino butyric acid at the central point of response surface experiment. It was obtained that the optimal processing for the accumulation of-amino butyric acid in germinated millet. The millet was soaked in 3.5 mmol/L CaCl2solution at 35℃ for 13 h and germinated at 31℃ for 48 h. The content of-amino butyric acid was obtained 251.46 mg/100 g in germinated millet under optimized condition, which was 2.90 times higher than the initial-amino butyric acid 86.72 mg/100 g. The maximum predicted value 254.19 mg/100 g of GABA content in germinated millet obtained by Response surface methodology was close to the actual value 249.47 mg/100 g, indicating that the formula designed by Response surface methodology was close to the actual situation and the suitability of the formula to be used in optimizing the conditions of germination for the millet. It can be seen that the Single factor experiment, Plackett-Burman experiment, Steepest ascent path experiment and Response surface methodology can effectively screen and optimize the significant factors affecting the GABA content in the germinated millet, and greatly increase the GABA content.

agricultural products, quality control, amino acid, millet; germinated;-amino butyric acid; Plackett-Burman experiment

程建軍，徐 麗，歐才智，郭蓮東，張高鵬，倪春蕾，丁陽月，江連洲.優(yōu)化催芽溫度及CaCl2溶液濃度提高發(fā)芽小米中-氨基丁酸含量[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2019，35(3)：301－308. doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2019.03.000 http://www.tcsae.org

Cheng Jianjun, Xu Li, Ou Caizhi, Guo Liandong, Zhang Gaopeng, Ni Chunlei, Ding Yangyue, Jiang Lianzhou. Optimization of germination temperature and CaCl2concentration to improveamino butyric acid content in germination millet[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2019, 35(3): 301－308. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2019.03.038 http://www.tcsae.org

2018-08-29

2019-01-18

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2017YFD0401200）

程建軍，教授，博士，研究方向?yàn)榧Z食、油脂及植物蛋白工程。Email：cheng577@163.com

江連洲，教授，博士，研究方向?yàn)榧Z食、油脂及植物蛋白工程。Email：jlzname@163.com

10.11975/j.issn.1002-6819.2019.03.038

TS210.4; S515

A

1002-6819(2019)-03-0301-08