李敏，和春林，嚴(yán)紅亞，信愛國，常志順*

(1. 云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院 養(yǎng)禽與禽病研究所，云南 昆明 650224；2. 硯山縣維摩鄉(xiāng)畜牧獸醫(yī)工作站，云南 硯山 663100；3. 麗江市古城區(qū)大東鄉(xiāng)農(nóng)業(yè)綜合服務(wù)中心，云南 麗江 674100)

新城疫是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)感染引起的一種急性、烈性、高度接觸傳染性禽類傳染病，被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)列為必報傳染病之一[1]。NDV屬于副黏病毒科，是一種單股、負(fù)鏈、線性、不分節(jié)段的RNA病毒，只有一個血清型，但因宿主范圍、毒力不斷演變，NDV 給養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。NDV根據(jù)致病力差異，可分為弱毒株、中等毒力株和強(qiáng)毒力毒株三種類型。

鴿新城疫，最早被稱為鴿副黏病毒病，是由I型禽副黏病毒引起的一種高度接觸性、敗血性傳染病。該病病原與雞NDV在血清學(xué)上沒有顯著差異，兩者基因序列同源性較高。隨著時間的推移及飼養(yǎng)方式的改變，鴿Ⅰ型副黏病毒呈現(xiàn)流行廣、傳播快的特點。迄今為止，我國華南、華北、華東等地區(qū)大部分省份都有該病的報道，給我國養(yǎng)鴿業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。

本實驗通過對云南某賽鴿公棚疑似自然感染NDV的病死鴿采集的病料進(jìn)行病原分離鑒定及分子流行病學(xué)分析，旨在為臨床診斷NDV感染提供實驗室檢測依據(jù)，了解云南省鴿源新城疫病毒感染情況以及為防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料

2018年5月，云南某賽鴿公棚出現(xiàn)幼鴿發(fā)病，發(fā)病率12%，死亡率8%，送到本研究所進(jìn)行臨床解剖及實驗室診斷，采集病料進(jìn)行分離鑒定。

1.1.1雞胚和NDV病毒

9日齡非免疫健康雞胚本研究所提供，LaSota株疫苗毒，本研究所保存。

1.1.2陽性血清

NDV、禽流感病毒(H5、H7、H9亞型)標(biāo)準(zhǔn)陽性HI血清購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，減蛋綜合征病毒(EDSV-76)HI血清由本研究所制備保存。

1.2 分子生物學(xué)試劑及引物合成

RNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。PCR所用的分子生物學(xué)試劑均購自TaKaRa公司。參考新城疫診斷國家標(biāo)準(zhǔn)(GB/ T 16550-2008)合成引物[3]，擴(kuò)增上游引物：5′-ATGGGCYCCAGAYCTTCTAC-3′，下 游 引 物：5′-CTGCCACTGCTAGTTGTGATAATCC-3′。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。擴(kuò)增產(chǎn)物直接送昆明碩擎生物科技有限公司測序。

1.3 病毒分離

采取病死鴿的肝、肺臟組織，剪碎，加滅菌生理鹽水研磨，反復(fù)凍融3次，加入雙抗(青霉素和鏈霉素)1000IU/mL， 4℃過夜，12000r/min離心5min，取上清液經(jīng)尿囊腔接種9日齡非免疫健康雞胚，置37℃孵化器內(nèi)培養(yǎng)7d，每12h觀察一次雞胚死亡情況。24h后死亡以及結(jié)束孵化時存活的雞胚置4℃冰箱4～24h，收獲尿囊液備用，觀察胚體病理變化。

1.4 病毒鑒定

1.4.1血凝(HA)和血凝抑制(HI)試驗

按照常規(guī)方法[4]測定收集的尿囊液的HA效價，并以抗NDV、EDSV、H5、H7、H9標(biāo)準(zhǔn)陽性血清進(jìn)行HI試驗。

1.4.2病毒MDT測定

參考國家標(biāo)準(zhǔn)(GB/ T 16550-2008)進(jìn)行 MDT 測定[3]，將病毒尿囊液用滅菌生理鹽水連續(xù)10倍稀釋；每個稀釋度經(jīng)尿囊腔接種5枚9日齡的SPF雞胚，每枚按0.1mL/接種，置37℃孵化器內(nèi)培養(yǎng)，棄去24h內(nèi)死亡胚，以后每6h照蛋一次，連續(xù)觀察7d，記錄各雞胚的死亡時間。按Karbre氏法計算EID50，并根據(jù)所有胚胎死亡的最高稀釋度計算MDT。

1.4.3病毒RNA的提取及PCR擴(kuò)增

取收集的病毒雞胚尿囊液300μL于滅菌的3mL EP管中，再加入1000μL Trizol試劑，混勻，室溫靜置10min；加入200μL氯仿，輕輕混勻，室溫作用10min；4℃、1200r/min離心15min；取上清，加入上清相同體積的異丙醇，振蕩混勻后室溫靜置10min；4℃、1200r/min離心10min；棄上清液，加 入1000μL 75%乙醇洗滌；4℃、1200r/min離心5min，棄去上清液，室溫靜置晾干，加40μL ddH2O溶解。提取的RNA立即進(jìn)行RT-PCR，RT-PCR步驟按試劑盒說明書進(jìn)行，PCR反應(yīng)條件為94℃ 3min，94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 45s，進(jìn)行35個循環(huán)，最后再72℃延伸7min。取5μL反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行2%的瓊脂糖凝膠電泳成像觀察。

1.4.4 PCR產(chǎn)物核酸序列測定及進(jìn)化樹的構(gòu)建

按DNA膠回收試劑盒的操作進(jìn)行PCR產(chǎn)物回收，送公司測序，參考已報道的方法[5]，根據(jù)已發(fā)表的NDV主要參考毒株構(gòu)建該毒株的系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹，所用NDV參考毒株信息見表1。

表1 所用NDV參考毒株信息

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)病鴿臨床癥狀及剖檢情況

經(jīng)臨床解剖及流行病學(xué)調(diào)查，初步診斷為疑似新城疫感染。發(fā)病鴿臨床癥狀表現(xiàn)為精神萎靡，羽毛蓬亂，體溫升高，食欲下降，咳嗽，呼吸困難，有黏性鼻液，張口呼吸，拉黃色或綠色稀便，翅膀下垂，有扭頭、轉(zhuǎn)圈等神經(jīng)癥狀，后期病鴿因癱瘓無法采食，衰竭死亡。耐過鴿扭頭、轉(zhuǎn)圈等神經(jīng)癥狀明顯。剖檢可見全身黏膜出血，淋巴結(jié)腫大、出血，腺胃黏膜出血、壞死，盲腸扁桃體腫大、出血，腦組織充血水腫。該公棚鴿發(fā)病前1周進(jìn)行過頸部皮下0.5mL/羽LaSota 株滅活疫苗免疫，經(jīng)檢測，發(fā)病鴿血清NDV抗體HI效價為 24～26。

2.2 接種后死亡胚體的病變觀察

接種24 h后雞胚開始陸續(xù)出現(xiàn)死亡，雞胚死亡時間為接種后24～96h，胚體全身性出血、水腫，頭頸部、足趾和翅膀出血嚴(yán)重,見圖1。

1、2、3為感染病毒后雞胚，4、5為正常雞胚

2.3 病毒鑒定

雞胚尿囊液毒可凝集雞紅細(xì)胞，雞胚死亡時間為接種后24～96h，其血凝性可被 NDV陽性血清抑制，不能被EDSV、H5、H7和 H9亞型的陽性血清抑制，證明所分離到的病毒為新城疫病毒，命名為Pi/YN/CH/0122/2018(簡稱YN0122)。

2.4 EID50及 MDT 的測定結(jié)果

盲傳2代后尿囊液毒HA效價為7log2，對雞胚的 EID50為 10-7.5/ 0.1mL；MDT為 66h，最小致死量為10-6，結(jié)果表明該分離株為中等偏強(qiáng)毒力毒株。

2.5 RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

對提取的病毒尿囊液RNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳觀察，結(jié)果得到約500bp目的核酸片段，與預(yù)期結(jié)果相符(見圖2)。

M：DNAMark；S：分離株病毒；+：NDV LaSota 株陽性對照；-：陰性結(jié)果對照

圖2目的片段PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.6 核酸序列比對分析

測定上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物核酸序列，應(yīng)用DNAStar 6.0對YN0122進(jìn)行序列拼接與比對分析，并用MegAlign軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(見圖3)。結(jié)果表明，分離株YN0122與傳統(tǒng)NDV疫苗LaSota株和標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株北京株F48E9、NDV V4株、鵝副黏病毒病代表株YG98-2C4的核苷酸序列同源性分別為81.2%、82.4%、81.4%和87.2%，同源性較低，遺傳距離較遠(yuǎn)，而與鴿源Italy分離株14VIR8258-2同源性為91.3%，遺傳距離較近。該毒株F基因裂解位點氨基酸序列為112R-R-Q-K-R-F117，與NDV強(qiáng)毒株的F 基因裂解位點的氨基酸結(jié)構(gòu)一致，見表1、表2。

表2 9株 NDV F基因核苷酸同源性的比較

1：YMF3(AY390313)；2： 14VIR8258-2(KU377537)；3： CHGDYF14(KR014814)；4：F48E9 (AY508514)；5：Lasota(DQ195265)；6： SFR-129(KX268689)；7： V4(JX524203)；8： YG98-2C4(AY390311)；9： YN0122

圖3基于NDV F基因的遺傳進(jìn)化樹

3 小結(jié)

本試驗采用傳統(tǒng)的雞胚接種方法分離病毒，病料接種雞胚盲傳 2 代后，發(fā)現(xiàn)收獲的雞胚尿囊液具有血凝活性，能與紅細(xì)胞發(fā)生凝集反應(yīng)，其 HA 效價為 24～26。HI 試驗結(jié)果證明，該分離株的血凝活性只能被NDV 標(biāo)準(zhǔn)陽性血清所抑制，初步鑒定該分離株為NDV。F2代尿囊液毒EID50為 10-7.5/ 0.1mL；MDT為 66h，最小致死量為10-6。用RT-PCR檢測，得到預(yù)期特異性擴(kuò)增目的片段。明確了從病死鴿子中分離到的是一株NDV。根據(jù)擴(kuò)增片段核酸系列比對分析證實，分離株YN0122 F基因編碼的氨基酸裂解位點序列為112R-R-Q-K-R-F117，與NDV強(qiáng)毒株的F基因裂解位點的氨基酸結(jié)構(gòu)一致，YN0122株具有中等毒力偏強(qiáng)的特征。

鴿新城疫病毒又稱鴿Ⅰ型副黏病毒，屬于副黏病毒科、副黏病毒屬，只有一個血清型，但不同毒株的毒力表現(xiàn)出很大的差異[5]，鴿Ⅰ型副黏病毒和雞新城疫病毒同為一屬，含有極為相似的抗原成分[6]。本實驗所分離到的鴿新城疫毒Pi/YN/CH/0122/2018株，根據(jù)試驗結(jié)果初步判定為中等偏強(qiáng)新城疫病毒，但有文獻(xiàn)報導(dǎo)，鴿新城疫病毒(鴿Ⅰ型副黏病毒)的毒力和致病性不能完全由F基因裂解位點的特征性結(jié)構(gòu)決定[7]，主要通過動物試驗的方法進(jìn)行測定[8]。因此，要弄清楚分離株的毒力和致病性，還需進(jìn)行動物回歸試驗。

此次發(fā)生疫情的賽鴿公棚免疫過LaSota 株滅活疫苗，正常及發(fā)病鴿新城疫血清抗體HI效價達(dá) 24～26。針對本次鴿源NDV感染不能提供完全的保護(hù)，可見，盡管NDV只有一個血清型，但不同毒株的毒力存在差異；本試驗YN0122株F蛋白基因與LaSota株同源性為81.2%，同源性較低，遺傳距離較遠(yuǎn)，生產(chǎn)實踐中使用LaSota疫苗對鴿進(jìn)行免疫存在免疫失敗的風(fēng)險。因此，了解鴿NDV的生物學(xué)特性，為新城疫的防制提供重要的理論依據(jù)。

鴿新城疫是一種急性、烈性傳染病，給賽鴿公棚造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。賽鴿公棚每年春季會從全國各地收購幼鴿，集中飼養(yǎng)、訓(xùn)練后參加秋季的賽飛比賽。復(fù)雜的幼鴿來源背景、疫苗免疫情況以及賽鴿在野外飛行訓(xùn)練過程中，易接觸到攜帶有新城疫病毒的野生鳥類，此養(yǎng)殖模式易使新城疫等傳染病發(fā)生并在鴿群中擴(kuò)散。因此，研究制定并實施包括新城疫在內(nèi)的疫病綜合防控措施對公棚賽鴿養(yǎng)殖尤顯重要。