遲鵬 彭建 谷付星

摘要：在對微納材料光學(xué)特性表征中，需要獲得分辨率更高的波長和強(qiáng)度的熒光圖像。普通的顯微鏡無法滿足測試的要求，因此將普通的成像顯微鏡、光譜儀以及納米移動臺組成激光掃描顯微鏡成像系統(tǒng)，并利用LabVIE開發(fā)了一套完整的集二維掃描采集與信號圖像處理一體的系統(tǒng)上位機(jī)軟件。掃描采集過程使用了低通濾波等數(shù)字信號處理方法消除光譜儀信號噪聲的影響。利用本系統(tǒng)測量硒化鎘納米帶、單層二硫化鉬得到了熒光強(qiáng)度圖像以及熒光峰值波長圖像，能分辨出最小波長為0.03nm的熒光。將采集長度與實(shí)際長度進(jìn)行比較并分析熒光強(qiáng)度差異，取得了較好的效果。

關(guān)鍵詞：激光掃描成像;LabVIEW;光譜儀去噪;熒光峰值波長圖像;熒光強(qiáng)度圖像

中圖分類號：0433.1;0435.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

引言

激光掃描共聚焦顯微鏡（confocal laser scan-ning microscope，CLSM）是20世紀(jì)80年代中期發(fā)展起來并得到廣泛應(yīng)用的新技術(shù)。CLSM用激光作掃描光源，逐點(diǎn)、逐行、逐面快速掃描成像，其優(yōu)良的性能在半導(dǎo)體、材料科學(xué)、生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。

激光掃描共聚焦顯微鏡系統(tǒng)采用精密的針孔濾波技術(shù)，使其不僅能夠保持高清晰度和層析成像能力，同時(shí)能對不同熒光成分選擇成像，確定熒光成分的含量。在光譜成像共聚焦顯微鏡中，有多種分光方案，張運(yùn)海等利用棱鏡分光移動狹縫的方法，得到了5～300mm波長分辨率的熒光圖像。李葉等利用不同的帶通濾波片得到不同波段的熒光。目前市面上的激光共聚焦掃描顯微鏡采集系統(tǒng)部分采用可調(diào)諧帶通濾波片和光電探測器連用，其最高分辨率為10mm左右。對于觀察半導(dǎo)體微納材料的自吸收，例如單層二硫化鉬、硒化鎘納米帶、納米線等其熒光峰值波長改變量不足1 nm，因此具有測量高精度波長分辨率的熒光顯微鏡是必要的。

1系統(tǒng)構(gòu)成

測量熒光光譜系統(tǒng)采用的是普通光學(xué)顯微鏡改裝的激光掃描成像顯微鏡，如圖1所示，主要包括激光光源、光學(xué)顯微鏡、納米移動臺、二向色鏡、聚焦鏡以及光譜儀組成。激光器選用的是波長為532nm的激光器，激光器發(fā)出的激光光斑直徑為1mm，所以要先對激光進(jìn)行縮束，利用兩個(gè)不同焦距的凸透鏡搭成的望遠(yuǎn)鏡光路將光斑縮小為100um。激光通過二向色鏡反射進(jìn)入100倍的聚焦物鏡中進(jìn)一步將光斑縮小，縮小的光斑照射在樣品上使樣品激發(fā)熒光，并通過物鏡進(jìn)行熒光收集，所得的光經(jīng)過聚焦鏡聚焦后將熒光通入光譜儀進(jìn)行采集。納米移動臺對樣品區(qū)域進(jìn)行移動掃描，納米移動臺的行程為4 mm，位移精度10nm，能夠達(dá)到實(shí)驗(yàn)所需精度。

2程序設(shè)計(jì)

2.1軟件設(shè)計(jì)

圖2為熒光圖像系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)功能圖，其主要包括系統(tǒng)配置和數(shù)據(jù)采集兩個(gè)方面。系統(tǒng)配置是將實(shí)驗(yàn)儀器的通訊以及參數(shù)進(jìn)行設(shè)置，數(shù)據(jù)采集是利用本套系統(tǒng)能夠得到的所有數(shù)據(jù)信息。圖3是采集程序的程序面板和流程圖。進(jìn)入程序后，首先進(jìn)行系統(tǒng)配置，需要將激光器、光譜儀、納米移動臺的設(shè)備串口編號選擇輸入程序，并對儀器進(jìn)行初始化。初始化完成后，選擇本次采集所得文件的存儲目錄，設(shè)置光譜儀的積分時(shí)間、濾波參數(shù)、納米移動臺的起始位置和終止位置以及采集步長，確定采集分辨率。系統(tǒng)設(shè)置完成后，點(diǎn)擊確定進(jìn)入數(shù)據(jù)采集，在數(shù)據(jù)采集界面中實(shí)時(shí)顯示納米移動臺在每一次移動時(shí)獲得的光譜，將光譜的熒光峰值強(qiáng)度以及波長挑選出來，繪制在強(qiáng)度三維圖和波長三維圖中。界面中有一個(gè)采集時(shí)間顯示模塊，可以觀察本次采集已經(jīng)經(jīng)過的時(shí)間以及距離完成所需的剩余時(shí)間，方便操作者得到采集數(shù)據(jù)。

2.2光譜儀信號處理

光譜儀的原理是使用光柵分光后將光打入線陣CCD中，將光信號轉(zhuǎn)化為電信號。使用的過程中會有熱噪聲，測試背景產(chǎn)生的其他光噪聲以及數(shù)據(jù)采集卡的模擬干擾信號，所以要對光譜儀采集的信號進(jìn)行處理以提取想要獲得的信號。針對三種噪聲，本文采用均值濾波、低通濾波以及背景扣除法來處理采集到的信號。

均值濾波是信號處理的常用方法，它有著計(jì)算速度快和容易實(shí)現(xiàn)等優(yōu)點(diǎn)，其原理是對光譜儀多次采集的波長強(qiáng)度信號加權(quán)平均，得到的平均值作為光譜儀采集的強(qiáng)度值。

低通濾波采用的是FIR（finite impulse response）濾波器濾波，它可以在保證任意幅頻特性的同時(shí)具有嚴(yán)格的線性相頻特性，同時(shí)保證其單位抽樣響應(yīng)是有限長的，其原理是信號通過一個(gè)FIR濾波器與其系數(shù)進(jìn)行卷積（即乘累加）的過程。在本實(shí)驗(yàn)中主要使用其低通功能，將光譜儀采集的高頻信號進(jìn)行濾除。

光譜儀在無光條件下會產(chǎn)生暗電流，在開啟后遮擋住進(jìn)光口，對其信號進(jìn)行收集，并和后來采集到所需要的信號值進(jìn)行相減以扣除暗電流噪聲。

在對光譜儀信號采集的過程中，使用上述三種濾波方法依次對光譜儀采集的初始信號進(jìn)行濾波。將經(jīng)過三種濾波后的圖像進(jìn)行對比如圖4所示，其中圖（a）為未經(jīng)濾波光譜儀的信號圖譜，圖（b）為濾波后光譜儀信號圖譜，可以看到，在濾波前光譜儀的信號平均強(qiáng)度在1150左右，噪聲幅值有200，信號幾乎無法觀察。經(jīng)過濾波后，無信號的波長強(qiáng)度值在0附近，噪聲幅值僅有20，能明顯觀察到560～740nm波段的信號。

3圖像分析比較

將光譜儀測得的強(qiáng)度信息和波長信息進(jìn)行提取，以納米移動臺的橫縱坐標(biāo)為XY軸，強(qiáng)度和波長信息作為z軸即可得到熒光強(qiáng)度圖像和熒光峰值波長圖像。圖5（a）（d）（g）分別是單層二硫化鉬、硒化鎘納米帶和硒化鎘納米線在照明光下的顯微鏡圖，圖5（b）（e）（h）是利用熒光成像系統(tǒng)采集對應(yīng)熒光強(qiáng)度圖以及（c）（f）（i）是采集對應(yīng)熒光峰值波長圖。每種樣品采集的圖像在照明光下的實(shí)際長度和使用搭建的系統(tǒng)的邊長對比如表1所示。

表1中實(shí)際長度是在照明光條件下利用CCD相機(jī)進(jìn)行測量所得的長度值，步進(jìn)長度為納米移動臺每次采集所前進(jìn)的步長，像素?cái)?shù)為采集圖像轉(zhuǎn)為bmp格式圖片后測量邊長所得的像素點(diǎn)個(gè)數(shù)，步進(jìn)長度與像素?cái)?shù)的乘積即為掃描系統(tǒng)所采集的長度。從表中可以看出，利用熒光成像系統(tǒng)采集的長度與實(shí)際長度的誤差值在1um以內(nèi)。

觀察圖4的熒光強(qiáng)度圖像（b）（e）（h），發(fā)現(xiàn)在硒化鎘納米帶兩端強(qiáng)度最高，其最高強(qiáng)度值為588，而在納米帶的中間部分強(qiáng)度值明顯低于兩端僅有220左右，硒化鎘納米線也有相同的現(xiàn)象，即在兩端的強(qiáng)度明顯高于中間，而對于微納材料單層二硫化鉬的強(qiáng)度其邊緣處的強(qiáng)度與中間的強(qiáng)度相差不大。上述現(xiàn)象說明硒化鎘納米材料中存在一種導(dǎo)波模式，當(dāng)激光照射激發(fā)其本征熒光時(shí)，熒光一部分向外部發(fā)射，另一部分在樣品端部表面進(jìn)行多次全反射，在納米線的兩端進(jìn)行積累，形成類似于FP腔的循環(huán)增益結(jié)構(gòu)，最終熒光從兩端射出。當(dāng)激光激發(fā)位置在兩端時(shí)，采集到的熒光包括外部發(fā)射的熒光以及在納米材料表面?zhèn)鬏數(shù)墓獠ǎ瑥?qiáng)度明顯高于中間位置。而在單層二硫化鉬中，由于材料厚度太?。?.8nm），在微納材料表面?zhèn)鬏數(shù)墓鉄o法通過端面反射返回原來位置，不能形成類似于FP腔的增益結(jié)構(gòu)，表面的光波從微納材料的任意邊界射出，邊界處的熒光強(qiáng)度略微高于中間。

觀察圖5的熒光峰值波長圖像（c）（f）（i），發(fā)現(xiàn)硒化鎘納米帶和納米線兩端的最強(qiáng)波長與中間的最強(qiáng)波長不同，其兩端波長相對中間發(fā)生了紅移，相比于中間移動了3nm左右。單層二硫化鉬則沒有發(fā)生紅移，其中部與邊緣僅僅只是強(qiáng)度差異。這是因?yàn)樵谖k納米線中由于熒光在兩端的強(qiáng)度大，導(dǎo)致硒化鎘的自吸收效應(yīng)使發(fā)射波長發(fā)生紅移。

將圖5采集微納材料的熒光峰值強(qiáng)度圖與熒光峰值波長圖作為對比，發(fā)現(xiàn)熒光峰值波長圖所測量的大小明顯大于熒光峰值強(qiáng)度圖。因此將采集硒化鎘納米帶的波長三維圖以及強(qiáng)度三維圖的橫截面與利用原子力顯微鏡（AFM）所測量的納米帶寬度的截面信息進(jìn)行作圖，結(jié)果如圖6所示。圖b（a）為硒化鎘納米帶的波長截面圖，圖6（b）為硒化鎘納米帶的強(qiáng)度截面圖像，圖6（c）為硒化鎘納米帶的寬度截面圖。我們可以觀察到采集的兩張三維圖的長度均比實(shí)際長度長，利用AFM測量納米帶的寬度為1 682um，強(qiáng)度截面所得到的寬度為2.4岬，波長截面圖的長度與實(shí)際長度相差最大為4.2 um。因?yàn)樵谶M(jìn)行高分辨率采集時(shí)，由于激光光斑的大小限制，微納材料邊緣的熒光會從小到大逐漸增強(qiáng)直至光斑完全照射在微納材料上，而熒光峰值波長只需要產(chǎn)生熒光就可以采集到相近的波長，最終在顯示時(shí)由于熒光強(qiáng)度在比較低時(shí)顯示程度較弱，熒光峰值波長圖所測量的大小明顯大于實(shí)際長度，導(dǎo)致在測量納米級別的長度時(shí)導(dǎo)致圖像不準(zhǔn)確。

4結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用的是利用光譜儀和顯微鏡系統(tǒng)搭建的實(shí)驗(yàn)裝置，光譜儀可以采集出目標(biāo)點(diǎn)350～900nm的可見光全光譜，并可以將所有掃描點(diǎn)的光譜圖保存起來便于分析。利用光譜儀直接讀取樣品激發(fā)的熒光信號，設(shè)置采集的積分時(shí)間，觀察較弱的熒光信號可以進(jìn)行長時(shí)間的積分曝光來提高信噪比可以得到熒光的波長信息和強(qiáng)度信息。同時(shí)由于光譜儀依靠光柵分光，可以得到高精度的熒光信號。依靠本實(shí)驗(yàn)制作的熒光掃描顯微鏡可以分辨出最小0.03nm的波長差異，相比于普通的共聚焦顯微鏡在波長分辨方面有著較大的提高。

同時(shí)利用LabVIEW軟件的讀取功能，在完成該點(diǎn)掃描后立即得到所需要的數(shù)據(jù)并在全部掃描后，得到所需的強(qiáng)度圖像和熒光圖像，并分析得到的圖像產(chǎn)生的誤差的原因。根據(jù)這些圖像信息經(jīng)過處理可以精確的顯示微納材料不同位置的發(fā)光強(qiáng)度差異以及發(fā)光波長差異，能夠更好地研究微納材料的結(jié)構(gòu)信息以及生長缺陷。