■胡雅楠 白卓安 周 婧 韓雨哲 葉仕根 王連順 劉真衛(wèi) 任同軍*

（1.大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連116023；2.北京二商生物科技有限公司，北京100000）

恩諾沙星（Enrofloxacin）又名乙基環(huán)丙沙星、恩氟沙星，屬于氟喹諾酮類（Fluoroquinolones，F(xiàn)Qs）,是第三代喹諾酮類（Quinolones）藥物，廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)動(dòng)物感染性疾病的預(yù)防和治療[1]。隨著我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖集約化程度不斷提高，水產(chǎn)動(dòng)物病害迅速增多，對(duì)魚(yú)藥的需求大大增加，濫用藥物等時(shí)有發(fā)生，致使魚(yú)體藥物殘留超標(biāo)，藥物富集，危害食品安全。在貴陽(yáng)市場(chǎng)檢測(cè)淡水魚(yú)體內(nèi)中氟喹諾酮類抗生素（FQs）的殘留情況發(fā)現(xiàn)，恩諾沙星和氧氟沙星殘留量均超過(guò)最大允許限量[2]。魚(yú)藥在動(dòng)物體內(nèi)殘留得到社會(huì)廣泛關(guān)注。

鯽（Carassius auratus），屬鯉形目，肉細(xì)嫩，味鮮美，為重要食用魚(yú)類和養(yǎng)殖對(duì)象[3]。近十多年來(lái)，隨著我國(guó)水產(chǎn)品進(jìn)出口量的持續(xù)增長(zhǎng)，鯽魚(yú)的養(yǎng)殖規(guī)模和養(yǎng)殖潛力也越來(lái)越大，其2016年總產(chǎn)量現(xiàn)已超過(guò)300萬(wàn)噸，是產(chǎn)量穩(wěn)定持續(xù)增長(zhǎng)的淡水經(jīng)濟(jì)魚(yú)類之一,在我國(guó)的淡水養(yǎng)殖中占據(jù)十分重要的地位[4]。

研究表明，恩諾沙星在水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)代謝消除速率比較慢，需要較長(zhǎng)的停藥期[1]。目前對(duì)恩諾沙星在水產(chǎn)動(dòng)物的研究，主要在機(jī)體內(nèi)的藥物動(dòng)力學(xué)及代謝消除速率等方面的研究，對(duì)降低水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)恩諾沙星的殘留量或加快恩諾沙星在機(jī)體內(nèi)代謝的研究很少。本研究以異育銀鯽（Carassius auratus gibelio）為試驗(yàn)對(duì)象，采用拌料給藥方式，研究異育銀鯽口服新型脫毒劑后，體內(nèi)恩諾沙星及代謝產(chǎn)物的殘留量，控制恩諾沙星及其代謝產(chǎn)物在異育銀鯽體內(nèi)殘留，為水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)提供用藥參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)飼料

試驗(yàn)飼料以魚(yú)粉、豆粕、玉米面、面粉、米糠、預(yù)混料、微晶纖維素為主要原料，將其混合均勻制作成基礎(chǔ)飼料（C），恩諾沙星組（E）飼料在基礎(chǔ)飼料中添加恩諾沙星(北京索萊寶科技有限公司，純度≥98%)，脫毒組（RE）飼料在基礎(chǔ)飼料中添加脫毒劑（北京二商生物科技有限公司）。具體飼料配方見(jiàn)表1。將飼料成分混勻后，放入制粒機(jī)（東南干燥設(shè)備有限公司，XL-250）壓成粒徑為3 mm的顆粒。飼料做好后放入-20℃冰箱保存。

表1 飼料配方（g/100 g）

1.2 試驗(yàn)魚(yú)及飼養(yǎng)

健康無(wú)病害的異育銀鯽來(lái)自于上海市海豐水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司，光明漁業(yè)養(yǎng)殖場(chǎng)，初始體重[（204.5±10.30)g]的126尾。試驗(yàn)前將鯽暫養(yǎng)一周并投喂基礎(chǔ)飼料以適應(yīng)試驗(yàn)環(huán)境。試驗(yàn)前禁食24 h，將126尾試驗(yàn)魚(yú)隨機(jī)分配到2×3個(gè)1噸圓形水槽中，每槽21尾，分為兩組，每組3個(gè)重復(fù)。24 h連續(xù)充氣。飼養(yǎng)試驗(yàn)進(jìn)行28 d，期間每天按照體重的1.5%投喂一次（18:00），投喂0.5 h后利用虹吸法吸取殘餌糞便，吸污后換水，換水量占總水體的1/3。養(yǎng)殖過(guò)程中每日觀察魚(yú)的攝食情況，水體溫度為17.2～18.0℃，溶解氧大于6 mg/l，pH值為7.3～7.8（n=28）。

1.3 試驗(yàn)方法與樣品采集

1.3.1 建立抗生素模型

馴養(yǎng)后，對(duì)照組投喂基礎(chǔ)飼料（C），恩諾沙星組（E）投喂含有恩諾沙星的飼料。6 d后，饑餓處理24 h，每缸隨機(jī)取3條試驗(yàn)魚(yú)測(cè)定其體重，之后用2 ml注射器魚(yú)尾靜脈采血（提前用肝素鈉溶液潤(rùn)洗），4℃靜置24 h，4 ℃、3 000 r/min離心10 min，取上清，用于測(cè)定血清酶。取血后于冰袋上解剖，取出肝胰臟，置于液氮中速凍，再保存到-80℃冰箱中用于分析非特異性免疫活性，取肌肉保存到-20℃冰箱，用于測(cè)定恩諾沙星含量。

1.3.2 脫毒試驗(yàn)

將已建立抗生素模型的試驗(yàn)魚(yú)均分為兩組，分別投喂添加脫毒劑的飼料（RE）和基礎(chǔ)飼料（GE）連續(xù)投喂21 d。分別在試驗(yàn)第14、21 d和28 d，每缸隨機(jī)取3條，取肌肉檢測(cè)恩諾沙星含量。28 d后參照第6 d方法采樣測(cè)定血清及肝胰臟的非特異免疫酶。

1.4 恩諾沙星含量測(cè)定

1.4.1 提取和凈化

取魚(yú)肌肉適量搗碎均勻，稱取均質(zhì)肌肉5.0 g，置于50 ml聚丙烯離心管中，加入20 ml 0.1 mol/l EDTA Mellvaine緩沖液，1 000 r/min漩渦混合1 min，超聲提取 10 min，4℃下1 000 r/min離心5 min，提取三次，合并上清液。HLB固相萃取柱（20 mg，6 ml）,使用時(shí)用6 ml水活化。將上清液以2～3 ml/min的速度過(guò)柱，棄去濾液，用2 ml 5%的甲醇水溶液淋洗，將小柱抽干，再用6 ml甲醇洗脫并收集洗脫液。用氮?dú)獯蹈上疵撘?，? ml 0.2%甲酸水溶液溶解，1 000 r/min漩渦混合1 min，用于Agilent（6470）高效液相色譜儀測(cè)定。

1.4.2 色譜條件

色譜柱為反相色譜柱C18柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)，流動(dòng)相為A（甲醇∶乙腈溶液=40∶60）和B（0.2%甲酸溶液），流速為0.2 ml/min，激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為 450 nm，柱溫為 40℃，進(jìn)樣量為20 μl。在該色譜條件下，恩諾沙星(20 ng/ml)的保留時(shí)間分別為5.84 min。

1.5 肝胰臟非特異性免疫指標(biāo)測(cè)定

準(zhǔn)確稱取組織樣品，在4℃冰箱緩溶，肝胰臟按質(zhì)量體積比1∶9（W/V）的比例加入0.9%的生理鹽水，在冰浴條件下勻漿制成組織勻漿，之后以2 500 r/min，4℃條件下，離心10 min,取上清液保存在-80℃?zhèn)溆?。肝胰臟抗氧化酶：堿性磷酸酶（AKP）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、總抗氧化能力（TAOC）和丙二醛（MDA）均使用南京建成生物工程研究所的試劑盒測(cè)定。

1.6 血清酶測(cè)定

鯽的血清酶主要使用迪瑞CS-300B全自動(dòng)生化分析儀（長(zhǎng)春迪瑞醫(yī)療科技股份有限公司）檢測(cè)谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶(AKP)和肌酐(CREA)。

1.7 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）”表示，試驗(yàn)結(jié)果用SPSS 21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，用Tukey's多重比較對(duì)全部處理組進(jìn)行方差分析，檢驗(yàn)組間差異是否顯著，以P＜0.05為顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 脫毒劑對(duì)恩諾沙星在鯽肌肉中殘留的影響(見(jiàn)圖1)

圖1 飼料中添加脫毒劑對(duì)鯽肌肉中恩諾沙星含量的影響

如圖1所示，飼料中添加脫毒劑能夠顯著降低鯽肌肉中恩諾沙星含量。RE組鯽肌肉中的恩諾沙星含量分別在14、21 d和28 d比GE組降低87.08%，44.97%和28.97%（P＜0.05）。RE組鯽肌肉中的恩諾沙星含量在7～14 d時(shí)消除速度較快，14 d后消除速度變慢直至21 d后基本趨于平穩(wěn)。GE組21 d后，恩諾沙星在鯽肌肉中消除速度趨于平穩(wěn)。

2.2 恩諾沙星對(duì)鯽肝胰臟抗氧化能力及MDA含量的影響（見(jiàn)表2）

表2 飼料中添加脫毒劑對(duì)鯽肝胰臟酶活的影響

如表2所示，與C組相比，投喂恩諾沙星6 d后，E組SOD活性顯著下降（P＜0.05），AKP、CAT、T-AOC活性和MDA含量都略有下降，但無(wú)顯著性差異。隨著RE組恩諾沙星的減少，肝胰臟AKP、SOD、T-AOC活性和MDA含量顯著低于GE組（P＜0.05）。

2.3 恩諾沙星對(duì)鯽血清酶的影響(見(jiàn)表3)

表3 飼料中添加脫毒劑對(duì)鯽血液酶活的影響

如表3所示，投喂添加恩諾沙星的飼料6 d與對(duì)照組相比，E組的AST和AKP活性都顯著升高，28 d后，RE組AST和AKP活性顯著高于C組，且AST活性顯著低于GE組（P＜0.05）。CREA均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

3 討論

3.1 脫毒劑對(duì)恩諾沙星在鯽肌肉中殘留的影響

藥物在牛、犬、兔、雞等動(dòng)物體內(nèi)發(fā)生代謝反應(yīng)的類型和程度不盡相同，恩諾沙星在異育銀鯽體內(nèi)以原藥存在形式達(dá)98%，部分恩諾沙星脫乙基后可以產(chǎn)生活性代謝物環(huán)丙沙星（＜0.30%）[5]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采取拌料給藥的方式給予鯽恩諾沙星后，鯽肌肉中有大量恩諾沙星蓄積,這與徐維海等[6]研究結(jié)果相似。RE組鯽肌肉中的恩諾沙星含量分別在14、21 d和28 d比GE組降低87.08%、44.97%和28.97%（P＜0.05）。且RE組鯽肌肉中恩諾沙星的含量在14 d低于安全濃度（＜100 μg/kg）[7]，但GE組鯽肌肉中恩諾沙星含量在28 d時(shí)，仍然高于安全濃度。由此飼料中添加0.05 g/100 g的脫毒劑促進(jìn)了恩諾沙星在鯽體內(nèi)的消除，降低了恩諾沙星的殘留量，縮短了恩諾沙星的休藥期。藥物在體內(nèi)的代謝反應(yīng)通常分為Ⅰ相反應(yīng)（又稱引入官能團(tuán)反應(yīng)，包括氧化、還原、水解和異構(gòu)化等）和Ⅱ相反應(yīng)（即結(jié)合反應(yīng)，藥物或者Ⅰ相代謝產(chǎn)物的極性基團(tuán)與內(nèi)源性物質(zhì)生成結(jié)合物）[8]。恩諾沙星在體內(nèi)的Ⅰ相代謝反應(yīng)是N-去烷氧化，其中細(xì)胞色素酶P450發(fā)揮重要作用。另一方面陳念祖等[9]研究表明硒能夠提高細(xì)胞色素氧化酶的活性。由此推測(cè)脫毒劑中含有的硒增強(qiáng)了細(xì)胞色素氧化酶，加快了恩諾沙星N-去烷氧化，促進(jìn)了恩諾沙星在鯽體內(nèi)的代謝。

3.2 恩諾沙星對(duì)鯽肝胰臟抗氧化能力及MDA含量的影響

肝臟的代謝功能主要依賴于肝內(nèi)酶的作用，肝內(nèi)酶含量及種類極其豐富，同時(shí)肝臟是外源性化合物在體內(nèi)進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化的主要器官，當(dāng)外源性中毒引起動(dòng)物肝臟發(fā)生損傷時(shí)，相應(yīng)地引起血清中一系列相關(guān)酶發(fā)生變化[10]。AKP是一種對(duì)底物專一性要求較低的磷酸單酯水解酶，是重要的解毒系統(tǒng)，廣泛存在于動(dòng)物的血液和各種器官內(nèi)，能夠通過(guò)改變病原體的表面結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)被侵襲機(jī)體對(duì)病原體的識(shí)別和吞噬能力，是水產(chǎn)動(dòng)物生理活動(dòng)和疾病診斷的一項(xiàng)重要指標(biāo)。朱建勇等[11]研究表明恩諾沙星對(duì)鯽魚(yú)的AKP具有一定的誘導(dǎo)作用，在給藥后的第5 d，藥物在魚(yú)體肝臟和腎臟組織內(nèi)濃度逐漸升高，到第10 d，肝臟和腎臟的AKP活性達(dá)到最高水平。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，AKP活性在28 d后仍然顯著高于C組，但RE組顯著低于GE組，原因可能是RE組恩諾沙星含量顯著低于GE組，RE組肝胰臟功能開(kāi)始恢復(fù)。SOD是一種重要的抗氧化酶，通過(guò)清除氧自由基來(lái)防止生物分子損傷。SOD是生物體內(nèi)唯一的以為底物的酶，可催化發(fā)生歧化反應(yīng)生成 H2O2，反應(yīng)方程式為+。Wise等[12]曾報(bào)道,長(zhǎng)期使用恩諾沙星,對(duì)魚(yú)的肝胰臟有較大的毒副作用。熊鏵龍等[13]研究表明雜交鱘肝臟抗氧化酶活性隨著恩諾沙星的暴露呈先誘導(dǎo)后抑制變化，且酶被誘導(dǎo)時(shí)間隨恩諾沙星的質(zhì)量濃度升高而下降。本試驗(yàn)高質(zhì)量濃度恩諾沙星處理鯽6 d后，SOD活性顯著下降,已經(jīng)處于抑制階段。28 d后，恩諾沙星含量已低于安全濃度，SOD活性顯著高于C組，應(yīng)處于誘導(dǎo)階段。這與環(huán)丙沙星處理鯽后GSH活性變化類似[14]。聶湘平等[14]推測(cè)隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)和恩諾沙星濃度下降，恩諾沙星不足以對(duì)酶蛋白產(chǎn)生了破壞時(shí)可能對(duì)SOD合成的酶活性產(chǎn)生誘導(dǎo)，導(dǎo)致SOD合成增強(qiáng)，含量增加。GE組恩諾沙星含量顯著高于RE組，其SOD含量也受誘導(dǎo)作用較強(qiáng)。過(guò)氧化氫在CAT的作用下生成水和氧氣，消除氧自由基對(duì)機(jī)體的氧化損傷[15]，本試驗(yàn)恩諾沙星處理6 d后CAT無(wú)顯著性變化，28 d后，RE組和GE組CAT活性顯著高于對(duì)照組和E組，可能是異育銀鯽體內(nèi)CAT活性的響應(yīng)比較滯后于藥物的積累時(shí)間。隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)和恩諾沙星濃度的下降,恩諾沙星對(duì)CAT的合成產(chǎn)生誘導(dǎo)作用。T-AOC就是一個(gè)體系中的大小分子和酶總和的水平，體現(xiàn)了該體系的抗氧化能力總和[16]。當(dāng)污染物存在，機(jī)體為了要清除因污染物脅迫產(chǎn)生的提高的氧自由基量而加快了抗氧化酶蛋白的合成，造成酶分泌的增加，這是機(jī)體正常的應(yīng)激反應(yīng)[17]。GE組T-AOC顯著高于RE組，應(yīng)該是魚(yú)體內(nèi)仍然存在較高的恩諾沙星，對(duì)鯽肝胰臟抗氧化能力的應(yīng)激作用。且值得注意的是，MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的最終產(chǎn)物，并且測(cè)量MDA水平可以反映動(dòng)物的脂質(zhì)過(guò)氧化程度。在外部環(huán)境破壞的情況下，氧自由基會(huì)攻擊多不飽和脂肪酸的生物膜，導(dǎo)致體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化。E組的MDA含量沒(méi)有顯著性變化，GE組的MDA含量顯著高于RE組，并與對(duì)照組差異不顯著，表明GE組機(jī)體仍然受到損害。

3.3 恩諾沙星對(duì)鯽血清酶的影響

魚(yú)類的血清生理生化指標(biāo)與機(jī)體的代謝、營(yíng)養(yǎng)狀況及疾病有著密切的關(guān)系，當(dāng)魚(yú)體受到外界因子的影響而發(fā)生生理或病理變化時(shí)，必定會(huì)在血液指標(biāo)中反映出來(lái)[18]。血清生化指標(biāo)是反映動(dòng)物環(huán)境應(yīng)激時(shí)體內(nèi)物質(zhì)代謝和組織器官機(jī)能狀態(tài)變化的一個(gè)重要特征[19]。當(dāng)機(jī)體某些因素使細(xì)胞膜遭受破壞，使其內(nèi)的酶釋放入血液的速度大大增高，血清中酶的活性才明顯升高[20]。AST催化谷氨酸與草酰乙酸之間的轉(zhuǎn)氨作用[21],若肝臟損傷導(dǎo)致線粒體受損，AST會(huì)大量釋出,使血清AST升高大于ALT[22],血清中AST活性越高，肝損傷則越嚴(yán)重。AKP雖然廣泛分布于動(dòng)物體各臟器器官中，但以酶原的形式存在于肝臟為最多，當(dāng)肝臟受到損傷或者障礙時(shí)經(jīng)淋巴和肝竇進(jìn)入血液，同時(shí)由于肝內(nèi)膽道膽汁排泄障礙，反流入血而引起血清堿性磷酸酶明顯升高[23-24]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，在連續(xù)6 d給予鯽高濃度恩諾沙星后，鯽血液中AKP和AST活性顯著升高，表明恩諾沙星對(duì)肝細(xì)胞造成損傷。28 d后，RE組與GE組AKP和AST活性有回落趨勢(shì),這表明停喂恩諾沙星后,肝胰臟的功能開(kāi)始恢復(fù)。且RE組AST顯著低于GE組，表明RE組鯽機(jī)體恢復(fù)速度快于GE組。CREA是肌肉組織中儲(chǔ)能物質(zhì)肌酸代謝的終產(chǎn)物,血清中肌酐濃度可作為腎小球?yàn)V過(guò)功能受損的指標(biāo)之一[24]。汪文選等[20]研究表明較低濃度的恩諾沙星對(duì)鯽的機(jī)體功能無(wú)顯著影響。本研究鯽血液中CREA無(wú)顯著變化，表明本研究中的恩諾沙星濃度對(duì)鯽腎臟無(wú)明顯影響。

4 結(jié)論

飼料中添加恩諾沙星投喂異育銀鯽6 d，恩諾沙星在鯽肌肉中大量蓄積。飼料中添加脫毒劑投喂異育銀鯽后，RE組鯽肌肉中恩諾沙星在21 d達(dá)到安全濃度，較GE組縮短一個(gè)星期，說(shuō)明飼料中添加脫毒劑促進(jìn)了恩諾沙星在鯽體內(nèi)的消除，顯著縮短投喂抗生素后的休藥期。