王雨婷，雷彩霞，程國威，夏 芮，李金枝,3*

(1.麗水學(xué)院 生態(tài)學(xué)院，浙江 麗水 323000；2.葛洲壩水務(wù)(臺州)有限公司，浙江 臺州 317500；3.臺州學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 臺州 318000)

金線蓮是我國傳統(tǒng)珍稀名貴中草藥，含有生物堿等大量活性成分，具有消炎、降壓、抗腫瘤、抗衰老、保肝等功效[1]。金線蓮種子細(xì)小、發(fā)育不完全，在自然條件下的萌發(fā)率和繁殖率低[2]，且其對生態(tài)環(huán)境條件要求嚴(yán)格，而近年來人為的過度采挖更導(dǎo)致了野生資源處于瀕臨滅絕之地[3]，急需進(jìn)行人工栽培。長期以來，人們用分株的方法很難實現(xiàn)大量繁殖，只有利用組織培養(yǎng)才能進(jìn)行快速大量繁殖[4]。多數(shù)研究認(rèn)為金線蓮莖段是最佳的快繁外植體[5-6]，也有認(rèn)為莖片最佳的研究[7]。在金線蓮誘導(dǎo)培養(yǎng)方面，對于不同激素的使用及用量方面存在較大差異[8-18]。為此，為進(jìn)一步優(yōu)化金線蓮組培快繁體系，并提高其有效成分的含量，對金線蓮的組織快繁體系進(jìn)行優(yōu)化，旨在為金線蓮的大量繁殖和開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗于2017年6-10月在麗水學(xué)院生態(tài)實驗樓進(jìn)行。金線蓮是蘭科開唇蘭屬花葉開唇蘭(Anoectochilusroxburghii(Wall.) Lindl.)，來自福建省漳州市南靖縣的福建金線蓮美人紅，購自網(wǎng)店“福建金線蓮苗廠家直銷”。選擇健壯、無病蟲害、根系發(fā)達(dá)、莖粗壯、株高6～11 cm的金線蓮幼苗作為試驗材料。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件 MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，設(shè)置不同濃度的激素組合，每個培養(yǎng)基都加入蔗糖3%和瓊脂0.7%，pH調(diào)至5.8，121℃滅菌20 min。參照前人對金線蓮組織培養(yǎng)在不同階段的培養(yǎng)基優(yōu)化方案，對不同階段的培養(yǎng)基設(shè)置系列優(yōu)化配方(表1)。

1) 誘導(dǎo)培養(yǎng)。在無菌條件下，將處理好的外植體(莖段和莖片)接入已滅菌的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每組接6瓶，每瓶接2個。接種后，置于培養(yǎng)室培養(yǎng)，溫度(25±2)℃，濕度50%～60%，光照強度約1 000 lx，光周期為16 h/8 h。通過對比不定芽的誘導(dǎo)情況篩選出最佳外植體和最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基。以MS+NAA 0.3 mg/L+ZT 0.15 mg/L為基本培養(yǎng)基，分別添加6-BA 1.0 mg/L、2.0 mg/L、3.0 mg/L和4.0 mg/L。

表1 金線蓮的組織培養(yǎng)在不同階段的培養(yǎng)基優(yōu)化試驗方案Table 1 Optimization scheme of media at different culture stages in A.roxburghii tissue culture

2) 增殖培養(yǎng)。經(jīng)過誘導(dǎo)培養(yǎng)后，按照不定芽的大小粗壯程度分為3組，將長勢一致的不定芽分別接入不同濃度的增殖培養(yǎng)基中，以保證每組增殖培養(yǎng)基中接入的不定芽長勢一致，進(jìn)而篩選出最佳增殖培養(yǎng)基。以MS+6-BA 2.0 mg/L為基本培養(yǎng)基，分別添加NAA 0.2 mg/L、0.4 mg/L和0.6 mg/L。

3) 生根培養(yǎng)。經(jīng)過增殖培養(yǎng)后，把叢生苗按長勢挑選分組，將長勢一致的叢生苗分別接入不同濃度的生根培養(yǎng)基中，以保證每組生根培養(yǎng)基中接入的叢生苗一致，進(jìn)而篩選出最佳生根培養(yǎng)基。以1/2 MS+IBA 1.0 mg/L+活性炭1.0 g/L+香蕉泥50 g/L為基本培養(yǎng)基，分別添加NAA 0.1 mg/L、0.3 mg/L和0.5 mg/L。

4) 總黃酮含量的測定。稱取干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品100 mg，加75%的乙醇溶解定容至250 mL，分別吸取0 mL(CK)、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL和0.5 mL于25 mL容量瓶中，補加蒸餾水至2.4 mL，用NaNO2-Al(NO3)3作顯色劑進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制和總黃酮的測定[19]，以金線蓮組培苗不添加蘆丁乙醇溶液為對照。

1.3 統(tǒng)計分析

采用Excel對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 誘導(dǎo)培養(yǎng)

試驗中接種的金線蓮莖片全部玻璃化，誘導(dǎo)率為0。以莖段為研究對象，從各組不定芽長勢最優(yōu)的外植體生長情況(圖1)看出，C組和D組不定芽長勢較好。莖段接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基50 d后，A、B、C和D組的誘導(dǎo)率分別為25%、17%、60%和25%，平均誘導(dǎo)率為31.75%，C組誘導(dǎo)率最高。綜上所述，金線蓮組培快繁的最佳外植體為莖段。C組所用培養(yǎng)基為最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS+NAA 0.3 mg/L+ZT 0.15 mg/L+6-BA 3.0 mg/L)。

圖1 金線蓮莖段誘導(dǎo)培養(yǎng)的不定芽生長情況Fig.1 Growth situation of adventitious buds of A.roxburghii stem segments on induction medium

2.2 增殖培養(yǎng)

將長勢一致的不定芽分別接入不同濃度的增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)，從每組側(cè)芽增殖的不定芽生長情況(圖2)看出，G組側(cè)芽增殖數(shù)明顯多于E組和F組。增殖培養(yǎng)55 d 后，E、F和G組的增殖倍數(shù)分別為2.20倍、1.00倍和4.75倍，G組的增殖倍數(shù)明顯高于E組，E組又明顯高于F組，且三者間的差異達(dá)顯著水平。由此可見，G組所用培養(yǎng)基是最佳增殖培養(yǎng)基(MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.6 mg/L)。

圖2 金線蓮的不定芽增殖培養(yǎng)產(chǎn)生的叢生苗Fig.2 Clustering plantlets produced by A.roxburghii adventitious buds on proliferation medium

2.3 生根培養(yǎng)

從圖3看出，叢生苗接入生根培養(yǎng)基25 d后，X組叢生苗平均有2～3條根，Y組2～6條，Z組3～5條。新根生根率從高到低依次為Z組、Y組和X組，分別為134%、100%和25%。Y組和Z組的生根效果都較好，但差異不顯著，在效果差異不大的情況下優(yōu)先采用濃度較低的處理，即Y組?？梢?，Y組所用培養(yǎng)基(1/2 MS+IBA 1.0 mg/L+活性炭1.0 g/L+香蕉泥50 g/L+NAA 0.3 mg/L)是最佳生根培養(yǎng)基。

圖3 金線蓮叢生苗的生根培養(yǎng)情況Fig.3 Rooting culture situation of A.roxburghii clustering plantlets

2.4 總黃酮含量

有文獻(xiàn)報道野生金線蓮總黃酮含量在0.64%～0.82%[20]，首先測得總黃酮含量測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=11.16x-0.002 7(R2=0.997 8)，然后依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線公式計算得到組培苗中總黃酮含量。試驗獲得的組培苗總黃酮含量高低依次為Y組、X組、Z組和對照，分別為1.04%、1.02%、0.92%和0.81%。金線蓮組培苗的總黃酮含量在0.92%～1.04%，與對照差異不大，但明顯高于野生金線蓮，其中Y組培養(yǎng)的組培苗略優(yōu)于X組和Z組。由此可見，Y組更有利于金線蓮中總黃酮含量的積累。

3 結(jié)論與討論

雖然前人已對金線蓮組織培養(yǎng)有過相關(guān)試驗，但是對于激素的種類及用量并沒有形成統(tǒng)一，因此在比較前人的試驗設(shè)計[8-18]后設(shè)置的本試驗方案，研究表明，在誘導(dǎo)培養(yǎng)階段添加ZT對誘導(dǎo)愈傷組織或不定芽具有明顯的效果，因此，把ZT作為試驗基本培養(yǎng)基的成分。6-BA作為一種細(xì)胞分裂素在愈傷組織和不定芽的形成過程中具有重要作用，因此6-BA的濃度配比至關(guān)重要，試驗以一系列6-BA的濃度梯度作為變量。而且，前人研究表明增殖培養(yǎng)和生根培養(yǎng)階段采用的激素種類差異不大，但激素濃度存在一定差異，因此，試驗選擇其中一種濃度配比上存在較大分歧的激素NAA作為變量進(jìn)行試驗，以期得到較優(yōu)的激素配比。

采用金線蓮的莖片和莖段作外植體，試驗結(jié)果表明莖片誘導(dǎo)率為0，不適宜作為金線蓮組培外植體，這可能是由于品種不同所造成[7]。莖段的誘導(dǎo)率為31.75%，相對較優(yōu)，由此可見金線蓮的組培快繁最佳外植體是莖段。

對金線蓮誘導(dǎo)、增殖和生根不同生長時期采用不同濃度配比的培養(yǎng)基配方進(jìn)行培養(yǎng)，得到金線蓮的最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+NAA 0.3 mg/L+ZT 0.15 mg/L+6-BA 3.0 mg/L，誘導(dǎo)率達(dá)60%；前人在使用莖段作為外植體誘導(dǎo)不定芽時，誘導(dǎo)率有較大差異：誘導(dǎo)率有25%～50%的，也有大于100%的[8-10]，相比較之下試驗設(shè)置的激素配比存在一定的可取性。最佳增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.6 mg/L，增殖倍數(shù)為4.75，優(yōu)于前人研究結(jié)果(增殖倍數(shù)多在2.5～4.5[7-13])，因此認(rèn)為，試驗得到的最佳增殖培養(yǎng)基具有一定的參考價值。最佳生根培養(yǎng)基為1/2 MS+ IBA 1.0 mg/L+活性炭1.0 g/L+香蕉泥50 g/L+ NAA 0.3 mg/L，生根率達(dá)134%；而前人研究的叢生苗生根率在30%～97%[14-18]，試驗得到的最佳生根培養(yǎng)基明顯優(yōu)于前人的，也具有重要參考價值。

金線蓮既具有觀賞價值又具有藥用價值。總黃酮是金線蓮的主要有效成分之一，其含量直接影響金線蓮的功效。經(jīng)過組培后的金線蓮總黃酮含量在0.92%～1.04%，明顯高于野生金線蓮，由此可見，試驗設(shè)置的培養(yǎng)基配方有利于金線蓮總黃酮的積累。試驗結(jié)果為金線蓮的大量繁殖和進(jìn)一步開發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù)。