葉 霄，侯 睿，李 鈺，孫 佩，童 文，黃位年，尹存平，楊 曉

(四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 經(jīng)濟(jì)作物育種栽培研究所，四川 成都 610300)

趕黃草又名扯根菜，是虎耳草科(Saxifragaceae)扯根菜屬(Penthorum)植物扯根菜(PenthorumchinensePursh.)的干燥地上部分。為傳統(tǒng)苗藥，甘、溫，利水除濕、祛痰止痛，用于黃疸、水腫和跌打損傷等癥[1]，具有抗氧化、保肝、健脾、退黃等功效，為中成藥“肝蘇顆?！薄ⅰ案翁K膠囊”的原料藥材，也可用于趕黃草茶等新資源食品；是四川古藺道地藥材；收錄于《中藥大辭典》[2]和《四川中藥志》[3]，目前《中國(guó)藥典》尚未記載。趕黃草中主要成分為黃酮化合物、有機(jī)酸、揮發(fā)油等[4-6]，以總黃酮或槲皮素為目標(biāo)提取物進(jìn)行提取工藝的研究較多[7-8]。目前其相關(guān)產(chǎn)品在國(guó)內(nèi)的銷售逐年上升，成為熱門地方藥材之一。國(guó)內(nèi)主要分布于華北、華東及云貴川等地。全世界僅中國(guó)原產(chǎn)的可作藥用。

化學(xué)誘變育種法是用不同化學(xué)誘變劑處理植物材料，從而引起形態(tài)特征的變異，然后根據(jù)育種目標(biāo)進(jìn)行鑒定和培育的方法，具有操作簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)方便、突變頻率高、突變范圍廣等特點(diǎn)，是目前新材料創(chuàng)制的重要手段[9-11]。其中甲基磺酸乙酯(EMS)是一種常見(jiàn)的烷化誘變劑，突變頻率高，能產(chǎn)生范圍較廣的突變類型如轉(zhuǎn)換、顛換等，目前廣泛應(yīng)用于各種作物的誘變育種[12-15]。趕黃草育種相關(guān)研究較少，育種方法單一，基本以系統(tǒng)選育為主要育種方法，化學(xué)誘變育種法在趕黃草育種上的應(yīng)用鮮見(jiàn)報(bào)道。因此，以四川省古藺縣趕黃草地方品種為基礎(chǔ)材料，采用系統(tǒng)選育法育成的新品種趕黃草1號(hào)[16]為原材料，使用EMS對(duì)其種子進(jìn)行誘變處理，探求EMS對(duì)趕黃草產(chǎn)量及品質(zhì)的影響，以期為后續(xù)創(chuàng)制趕黃草優(yōu)質(zhì)突變體材料奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試的趕黃草材料為趕黃草1號(hào)，來(lái)源于四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物育種栽培研究所；誘變劑為甲基磺酸乙酯(EMS)，由美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)時(shí)間及地點(diǎn)

EMS化學(xué)誘變處理于2016年12月在成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，2017年1月在四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物育種栽培研究所進(jìn)行發(fā)芽及田間試驗(yàn)，10月進(jìn)行品質(zhì)測(cè)定。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 試劑配置 溶質(zhì)為EMS誘變劑，溶劑是pH 6.5的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(Na2HPO4·12H2O-Na2HPO4·H2O)，分別配置為6種濃度EMS溶液：0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%和1.1%。

1.3.2 EMS誘變?cè)囼?yàn) 稱取趕黃草1號(hào)種子各0.5 g，分別加到裝有500 μL上述不同EMS濃度的EP管中，放置于26℃、110 r/m的搖床內(nèi)，分別誘變處理5 h、10 h和15 h。誘變處理后，用pH 6.5的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖溶液潤(rùn)洗，每隔0.5 h換1次磷酸鹽緩沖溶液，沖洗3 h后用自來(lái)水沖洗2 h。設(shè)置清水對(duì)照，3次重復(fù)，共63個(gè)處理。

1.3.3 發(fā)芽率試驗(yàn) 在試驗(yàn)田內(nèi)取一定量土壤，過(guò)0.5 mm鐵篩，放入烘箱以105℃烘干8 h備用。稱取土壤15 g放入直徑8 cm的培養(yǎng)皿，整理平整，記錄重量，放入干燥箱烘3 h，直到恒重。將加入趕黃草種子的培養(yǎng)皿放入恒溫培養(yǎng)箱，每天稱量培養(yǎng)皿重量，水分揮發(fā)后加水保持恒重。萌發(fā)條件：溫度15℃，土壤水分55%，光照強(qiáng)度100%。3次重復(fù)，記錄發(fā)芽數(shù)目(發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)為胚根長(zhǎng)度等于種子長(zhǎng)度)。

1.3.4 田間試驗(yàn) 將處理好的趕黃草種子在試驗(yàn)田進(jìn)行育苗移栽，按小區(qū)種植。試驗(yàn)采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，3次重復(fù)。小區(qū)內(nèi)趕黃草種植10行，每行20株，共計(jì)200株。小區(qū)面積6.0 m2(4.0 m×1.5 m)。小區(qū)周圍設(shè)保護(hù)行。按照趕黃草種植標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行田間管理，對(duì)整齊度、株高、株直徑、分枝數(shù)等進(jìn)行詳細(xì)調(diào)查。果期收獲后對(duì)小區(qū)總鮮重和葉鮮重進(jìn)行測(cè)量，并計(jì)算葉比重。

1.3.5 總黃酮含量測(cè)定 將收獲后的趕黃草進(jìn)行取樣分析，參考《中華人民共和國(guó)藥典》(2015年版)山楂葉項(xiàng)下總黃酮含量測(cè)定[17]，采用紫外分光光度法測(cè)定總黃酮含量：在420 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)。

1.3.6 槲皮素含量測(cè)定 按照《四川省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》(2010年版)規(guī)定的高效液相色譜法[3]測(cè)定樣品中槲皮素含量。

1.3.7 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 22.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析、Duncan多重比較及Duncan單因素統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 EMS誘變后趕黃草的發(fā)芽率

從表1和圖1看出，所有處理的趕黃草種子發(fā)芽率均低于對(duì)照，且隨EMS濃度上升，發(fā)芽率總體呈下降趨勢(shì)，下降幅度為30%～85%，表明EMS對(duì)趕黃草種子出苗具有抑制作用。趕黃草種子受EMS濃度、浸種時(shí)間的綜合影響，發(fā)芽率表現(xiàn)不同變化趨勢(shì)。以對(duì)照平均發(fā)芽率的1/2(即42%)為半致死劑量判斷標(biāo)準(zhǔn)，所有處理中發(fā)芽率低于42%的占50.00%，低于20%的占27.78%，最低發(fā)芽率僅為13%。綜合考慮，EMS濃度為0.5%的趕黃草種子發(fā)芽率為40%～60%，處理隨時(shí)間的變化相對(duì)穩(wěn)定，因此認(rèn)為，EMS濃度0.5%是趕黃草種子誘變的較宜濃度。

經(jīng)方差分析和多重比較結(jié)果，F(xiàn)EMS濃度=11.6370>F0.05，F(xiàn)反應(yīng)時(shí)間=2.5740

表1 EMS誘變后趕黃草的發(fā)芽率Table 1 Germination rate of P.chinense treated with EMS %

注：同列不同大、小寫(xiě)字母分別表示差異達(dá)極顯著水平(P≤0.01)和顯著水平(P≤0.05),下同。
Note: Different capital and lowercase letters in the same column indicate significant difference atP<0.05 andP<0.01 level respectively.The same below.

圖1 EMS誘變后趕黃草的發(fā)芽率變化趨勢(shì)Fig.1 Variation trend in germination rate of P.chinense treated with EMS

2.2 EMS誘變后趕黃草的株高及株直徑

從表2看出，在分枝期(5月下旬)和現(xiàn)蕾期(6月下旬)，經(jīng)EMS誘變后有88.89%處理的趕黃草株高低于對(duì)照。其中分枝期的EMS濃度1.1%+誘變15 h后的植株最矮，較對(duì)照降低40.87%。經(jīng)EMS誘變后果期(9月下旬)有61.11%的處理植株高度高于對(duì)照。誘變后的趕黃草在分枝期植株直徑均小于對(duì)照；現(xiàn)蕾期有55.56%的植株大于對(duì)照，最大株直徑處理為EMS濃度0.3%+反應(yīng)時(shí)間15 h(9.03 mm)；果期有77.78%植株直徑較對(duì)照有提升，EMS濃度0.9%+誘變15 h處理的植株直徑最大(11.83 mm)。

經(jīng)EMS誘變后的趕黃草較對(duì)照在成長(zhǎng)初期矮小瘦弱，到現(xiàn)蕾期逐漸粗壯，果期高大粗壯，株高與植株直徑多優(yōu)于對(duì)照。因此，植株發(fā)生歪斜的概率更小，更加抗倒伏。EMS濃度0.9%+反應(yīng)時(shí)間15 h處理的材料在成長(zhǎng)期株高適宜、果期植株直徑最大，可作為趕黃草抗倒伏材料的候選。

表2 經(jīng)EMS誘變后趕黃草的株高和株直徑Table 2 Plant height and diameter of P.chinense treated with EMS

2.3 經(jīng)EMS誘變后趕黃草的產(chǎn)量

從表3看出，經(jīng)EMS誘變后趕黃草小區(qū)總鮮重有61.11%的低于對(duì)照，但有66.67%葉鮮重等于或高于對(duì)照，其中EMS濃度0.3%+誘變15 h處理的葉鮮重增產(chǎn)最大，較對(duì)照增加30.19%；77.78%處理的葉比重高于對(duì)照，其中EMS濃度1.1%+誘變15 h的處理最大，較對(duì)照增加28.36%。說(shuō)明EMS誘變?cè)诖龠M(jìn)趕黃草分枝及增加葉比重方面有突出效果。根據(jù)目前市場(chǎng)觀察，趕黃草以葉片需求為主，其經(jīng)濟(jì)價(jià)值主要體現(xiàn)在葉片重量上，故EMS誘變對(duì)于提高趕黃草葉產(chǎn)量有較大優(yōu)勢(shì)。EMS濃度0.3%+誘變15 h處理葉鮮重較對(duì)照增產(chǎn)30.19%，在經(jīng)濟(jì)價(jià)值上有較大優(yōu)勢(shì)，可作為葉用型趕黃草高產(chǎn)量材料的候選。

表3 經(jīng)EMS誘變后趕黃草的小區(qū)產(chǎn)量和葉比重Table 3 Yield/plot and leaf mass per area of P.chinense treated with EMS

2.4 EMS誘變劑對(duì)趕黃草品質(zhì)的影響

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線y= 29.87x+ 0.011，r=0.999 5。方法學(xué)考察結(jié)果：儀器精密度良好，試驗(yàn)方法重復(fù)性和穩(wěn)定性良好。

經(jīng)方差分析，總黃酮含量的FEMS濃度= 0.779 0F0.05；槲皮素含量的FEMS濃度= 0.718 0

表4 經(jīng)EMS誘變后趕黃草的總黃酮和槲皮素含量Table 4 Total flavonoid and quercetin content of P.chinense treated with EMS %

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，趕黃草不同農(nóng)藝和品質(zhì)性狀對(duì)EMS誘變濃度及反應(yīng)時(shí)間有不同的需求：對(duì)發(fā)芽率而言，EMS濃度顯著而反應(yīng)時(shí)間不顯著，0.5%為最優(yōu)EMS濃度水平；對(duì)于植株高和植株直徑，EMS濃度0.9%+誘變15 h處理的株高適宜，果期株直徑最大，擁有最佳抗倒伏能力，可作為優(yōu)秀育種親本材料；EMS濃度0.3%+誘變15 h處理小區(qū)葉鮮重產(chǎn)量最高；對(duì)于總黃酮和槲皮素含量，趕黃草中總黃酮與槲皮素含量對(duì)EMS反應(yīng)時(shí)間較敏感，其中EMS濃度0.5%+誘變10 h處理的總黃酮最高，EMS濃度0.1%+誘變15 h處理的槲皮素含量最高?？梢钥闯鯡MS誘變濃度和時(shí)間在范圍設(shè)計(jì)上并不十分合理，還有較大改進(jìn)空間。反應(yīng)濃度應(yīng)在0.1%之前增加梯度，在0.9%之后減少梯度，并且以0.5%為核心濃度，改進(jìn)的濃度范圍為0.05%～0.9%。大部分最優(yōu)材料反應(yīng)時(shí)間集中在15 h，故應(yīng)在15 h之后增加梯度，改進(jìn)的時(shí)間范圍為10～30 h。

研究參考《四川省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》及部分研究將總黃酮和槲皮素作為趕黃草有效成分指標(biāo)。而近年來(lái)許多研究提出，應(yīng)考慮將總黃酮中的趕黃草酮B[18]和沒(méi)食子酸[19-20]等也作為指標(biāo)成分。故在今后的研究中，應(yīng)以更豐富的指標(biāo)成分對(duì)趕黃草進(jìn)行測(cè)定與研究。

本試驗(yàn)主要從誘變后代的田間性狀及有效成分含量變化情況分析趕黃草的誘變特性，并未從分子層面對(duì)這些突變體產(chǎn)生的機(jī)理及其遺傳物質(zhì)的改變進(jìn)行研究，尚需進(jìn)一步對(duì)趕黃草DNA進(jìn)行損傷程度判定及變異程度分析，有利于深入認(rèn)識(shí)EMS對(duì)于趕黃草的誘變作用，為趕黃草的新品種選育奠定更多基礎(chǔ)。