王慶軍，羅 華，畢潤霞，趙麗娜，郝兆祥

(棗莊市石榴研究中心/棗莊市嶧城區(qū)果樹中心，山東 棗莊 277300)

石榴(PunicagranatumL.，2n=16)為石榴科(Punicaceae)石榴屬(PunicaL.)落葉灌木或小喬木，在我國南方則變?yōu)槌＞G灌木或小喬木，又稱安石榴、若榴等，原產(chǎn)于伊朗、阿富汗等，在長期傳播和栽培過程中因基因突變、天然雜交、人工選擇等原因形成了許多變異資源，極大豐富了石榴遺傳多樣性[1-2]。石榴在我國已有2 000多年的栽培歷史[3-4]，形成了新疆、陜西、四川、云南、安徽等著名的石榴產(chǎn)區(qū)，山東棗莊為我國古老的石榴產(chǎn)區(qū)之一，主要分布于嶧城區(qū)等地[5-6]。近年來，棗莊市嶧城區(qū)果樹中心和山東省林業(yè)科學(xué)研究院合作選育出國內(nèi)首個，也是目前唯一個國家級“秋艷”石榴良種(編號：魯S-SV-PG-024-2015)和2個省級石榴良種“青麗”(編號：魯S-SV-PG-023-2015)和“桔艷”(編號：魯S-SV-PG-024-2015)。這些石榴良種推廣于生產(chǎn)，已產(chǎn)生了巨大的經(jīng)濟、生態(tài)和社會效益。

分子標記是以個體間遺傳物質(zhì)內(nèi)核酸序列變異為基礎(chǔ)的新型遺傳標記，是DNA分子水平遺傳多態(tài)性的直接反映[7]。簡單重復(fù)序列間擴增(inter simple sequence repeat，ISSR)是以DNA重復(fù)序列為核心，運用PCR技術(shù)和重復(fù)序列技術(shù)組合發(fā)展起來的一種微衛(wèi)星基礎(chǔ)上的擴增多態(tài)性分子標記，具有擴增片段長度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism，AFLP)、隨機擴增多態(tài)性DNA標記(random amplified polymorphic DNA，RAPD)和簡單重復(fù)序列標記 (Simple Sequence Repeats，SSR)的優(yōu)點，具有使用方便、成本低、結(jié)果重現(xiàn)性較高、可靠性高等特點[8-9]。目前，對秋艷、青麗和桔艷等3個石榴良種分子標記方面的研究未見報道，而且當(dāng)葉片、枝條等材料脫離石榴植株個體后，良種無性繁殖在形態(tài)上很難區(qū)別，常出現(xiàn)假冒良種，會對石榴產(chǎn)業(yè)造成不利影響，制約石榴良種化進程。因此，采用新型分子標記對3個石榴良種離體材料進行分子鑒別，對保護石榴良種資源，促進石榴產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要的現(xiàn)實意義。為此，筆者等采用ISSR 分子標記技術(shù)，以石榴嫩葉為試材，提取石榴葉片基因組DNA作為模板，從24個石榴品種中探索秋艷、青麗和桔艷的分子鑒別技術(shù)體系，以期為石榴良種的推廣栽植和分子標記輔助選擇育種奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

24個山東石榴品種(表1)均來源于棗莊市石榴國家林木種質(zhì)資源庫。2017年5月采集每個品種健康枝條的嫩葉30 g，用液氮速凍后放于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 供試24個山東石榴品種名稱Table 1 Name of 24 tested P.granatum varieties in Shandong

1.2 試驗方法

1.2.1 石榴基因組DNA的提取與檢測 采用改良CTAB法[10]提取石榴嫩葉的基因組DNA。用0.8%(w/v)的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性，用德國IMPLEN P300核酸蛋白超微量紫外分光光度計檢測基因組DNA的純度和濃度，-20℃冰箱保存，把DNA用TE稀釋至終濃度為50 ng/μL，放入4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物篩選及ISSR-PCR擴增 從ISSR隨機引物中篩選出8條多態(tài)性好、譜帶清晰、擴增穩(wěn)定的引物(由上海桑尼生物科技有限公司合成，表2)對3個石榴良種進行ISSR-PCR擴增。PCR反應(yīng)總體系25 μL：ddH2O 10.5 μL、2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL、10 μmol/L引物1 μL、50 ng/μL模板DNA 1 μL。采用梯度PCR儀進行擴增，擴增條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，退火30 s，72℃延伸2 min，35個循環(huán)；72℃再延伸10 min；最后4℃保存。PCR擴增產(chǎn)物采用尼康 D 3000拍照保存。

表2 ISSR-PCR擴增所用的引物及退火溫度Table 2 Primers and annealing temperature for ISSR-PCR amplification

1.3 數(shù)據(jù)處理

電泳結(jié)果用Alphaview SA軟件讀取譜帶分子量，譜帶分子量用DL 2000 DNA Marker作為標準，由軟件分析得到各條譜帶的分子量大小。同一引物在相同遷移率位置譜帶清晰可辨的記為“1”，模糊或缺失的記為“0”[11]。統(tǒng)計所有ISSR引物的擴增結(jié)果，建立“0，1”矩陣和3個山東石榴良種的特征圖譜，用于分子鑒別分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 秋艷特異性分子標記引物的確定

從引物UBC811對山東24個石榴品種擴增結(jié)果的“0，1”矩陣(表3)看出，在2 000 bp處，品種1、12、13、15、22、23無帶，而其余品種有帶，所以這6品種與其余品種能區(qū)分開；在1 700 bp處，品種1、12有帶，品種13、15、22、23無帶，所以能將前后品種區(qū)分開；在1 489 bp處，品種1無帶，品種12有帶，能將兩者區(qū)分開。因此，在此24個石榴品種中，引物UBC811可以作為秋艷的特異性引物。

從引物UBC834對山東24個石榴品種擴增結(jié)果的“0，1”矩陣(表4)看出，在800 bp處，品種1、3、4、5、7、12、20、21、22有帶，而其余品種無帶，所以能將這9個品種與其余品種區(qū)分開；在1 384 bp處，品種1、3、5、7、22無帶，品種4、12、20、21有帶，所以能將前后品種區(qū)分開；在881 bp處，品種1、3、5、22有帶，品種7無帶，所以能將品種7與其余品種區(qū)分開；在856 bp處，品種1、5無帶，品種3、22有帶，所以能將前后品種區(qū)分開；在680 bp處，品種1有帶，品種5無帶，所以能將品種1、5區(qū)分開。因此，在24個品種中，引物UBC834可以作為秋艷的特異性引物。

8條引物對秋艷石榴良種擴增結(jié)果的條帶特征圖譜見表5。

表3 引物 UBC811對山東24個石榴品種擴增結(jié)果的“0，1”矩陣Table 3 “0，1” matrix of 24 tested P.granatum varieties amplified by primer UBC811 in Shandong

注：“0”代表此處無帶，“1”代表此處有帶，下同。
Note:“0”indicates there is no band; “1” indicates there is a band.The same below.

表4 引物UBC834對山東24個石榴品種擴增結(jié)果的“0，1”矩陣Table 4 “0，1” matrix of 24 tested P.granatum varieties amplified by primer UBC834 in Shandong

表5 8條引物對秋艷擴增結(jié)果的條帶特征Table 5 Band profile of Qiuyan P.granatum variety amplified by 8 primers bp

2.2 桔艷、青麗特異性分子標記引物的確定

從引物UBC835對山東24個石榴品種擴增結(jié)果的“0，1”矩陣(表6)看出，在1 888 bp處有無條帶，可將品種1、2(青麗)、4、17～24與其余品種區(qū)分開；在328 bp處可將品種2與品種1、4、17～24區(qū)分開。同理，結(jié)合476 bp、287 bp處有無條帶，可將品種3(桔艷)與其他品種區(qū)分開。因此，在此24個石榴品種中，引物UBC835可作為青麗與桔艷的特異性引物。

從引物UBC840對山東24個石榴品種擴增結(jié)果的“0，1”矩陣(表7)看出，在705 bp處無條帶、650 bp處有條帶，可將品種1、2、3、5、7、8、9、14、15與其余品種區(qū)分開；在1 023 bp處有無條帶，可將品種2、9與品種1、3、5、7、8、14、15區(qū)分開；在500 bp有無條帶，可將品種2與品種9區(qū)分開。在262 bp處有無條帶，可將品種3與其他品種區(qū)分開。因此，在此24個石榴品種中，引物UBC840可作為青麗與桔艷的特異性引物。

8條引物對青麗、桔艷良種擴增結(jié)果的條帶特征圖譜分別見表8和表9。

表6 引物 UBC835對山東24個石榴品種擴增結(jié)果的“0，1”矩陣Table 6 "0，1" matrix of 24 tested Punica granatum varieties amplified by primer UBC835 in Shandong

表8 8條引物對青麗擴增結(jié)果的條帶特征Table 8 Band profile of Qingli P.granatum variety amplified by 8 primers bp

表9 8條引物對桔艷擴增結(jié)果的條帶特征Table 9 Band profile of Juyan P.granatum variety amplified by 8 primers bp

3 結(jié)論與討論

采用優(yōu)化的ISSR-PCR反應(yīng)體系，對秋艷、青麗和桔艷3個石榴良種進行ISSR-PCR分析，從ISSR隨機引物中篩選多態(tài)性好、譜帶清晰、擴增穩(wěn)定的8條ISSR引物，利用這些引物對建立“0，1”矩陣，秋艷的2條特異性分子標記引物為UBC811與UBC834；青麗、桔艷的2條特異性分子標記引物為UBC835與UBC840，同時獲得了3個石榴良種各自的特征圖譜，初步建立了分子鑒別體系，為山東石榴良種的分子鑒定奠定了理論基礎(chǔ)。

近年來，大多數(shù)研究者采用分子標記對石榴種質(zhì)資源進行親緣關(guān)系和遺傳多樣性分析[12-17]。ISSR分子標記快速易操作，設(shè)計引物隨機，無需預(yù)知基因組序列，同時具有AFLP、SRAP、RAPD 等分子標記的優(yōu)點，比AFLP、SRAP、RAPD 等標記更適用于不同良種之間的分子遺傳學(xué)研究，有利于石榴遺傳圖譜構(gòu)建、分子標記輔助選擇育種及其他相關(guān)分子遺傳學(xué)研究。目前，可應(yīng)用于秋艷、桔艷和青麗的分子鑒別研究的ISSR引物較少，需加大引物開發(fā)力度，以實現(xiàn)這3個石榴良種的精準分子鑒定，從分子水平上提升山東石榴良種化進程。