肖 偉，蔡剛志，華再東，任紅艷，朱 喆，肖紅衛(wèi)，鄭新民，顧玉芳，畢延震，楊玉瑩*

(1.長江大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025；2.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，動物胚胎工程及分子育種湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430064；3.高原山地動物遺傳育種與繁殖省部共建教育部重點實驗室，貴州 貴陽 550025；4.貴州省動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，貴州 貴陽550025；5.貴州大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽550025)

肌肉抑制素(Myostatin，MSTN) 基因全長6.7 kb，編碼區(qū)由2 個內(nèi)含子和3 個外顯子組成。MSTN 又稱為TGF-8 基因(growth differentiation 8 ) ，是TGF-β(growth differentiation factor beta) 蛋白家族中的一員[1]，是調(diào)節(jié)肌肉細(xì)胞生長發(fā)育的負(fù)調(diào)控因子。肌肉抑制素敲除后，動物體內(nèi)對胰島素的敏感性增強，糖的攝取效率更高[2]，肌肉組織異常發(fā)達，呈現(xiàn)“雙肌”性狀[3]。研究表明，敲除Smad3基因后會導(dǎo)致MSTN高表達，從而造成肌肉萎縮癥發(fā)生[4]。因此，MSTN在脂肪沉積過程中有著至關(guān)重要的作用，但其在脂肪沉積的分子通路中的機理還未明了。

轉(zhuǎn)錄因子MEF2C(Myocyte enhancer factor 2C)對脂肪組織基因表達也有調(diào)控作用，在C-ski 敲除小鼠的白色脂肪組織中，MEF2C 的表達上調(diào)3.64 倍，導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)脂肪減少的表型[5]。MEF2C 受RBM4(RNA binding motif protein 4)的可變剪接調(diào)控，同時RMB4 啟動子可被MEF2C 結(jié)合，二者共同形成前饋環(huán)路，調(diào)控棕色脂肪組織的形成[6]，類似的結(jié)果也被多個研究證實[7]。另有研究觀察MSTN 與MEF2C 的調(diào)控關(guān)系，比如在山羊胚胎成纖維細(xì)胞中，采用慢病毒介導(dǎo)的RNA 干擾沉默MSTN 表達后，發(fā)現(xiàn)MEF2C表達上調(diào)[8]；而在骨骼肌細(xì)胞里，MSTN 敲除后引起MEF2C 下調(diào)[9]。由此可見，在不同的細(xì)胞環(huán)境中，MSTN 與MEF2C 的調(diào)控關(guān)系可能有所不同。

微小非編碼RNA-222(miR-222 )在進化上極為保守，被認(rèn)為是一個抑脂因子。miR-222 與人的體重身高指數(shù)(BMI)呈負(fù)相關(guān)，說明其與脂肪沉積的關(guān)系密切[10]。小鼠的3T3-L1 前脂肪細(xì)胞及人的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化時，miR-222的表達下調(diào)；相反，高表達miR-222 則可抑制兩者向脂肪細(xì)胞生成[11-12]。豬脂肪組織miRNA 表達譜的研究也揭示miR-222 在脂肪里的表達豐度較高，可能參與脂肪沉積，但具體機制不明確[13]。為了進一步探索MSTN通過MEF2C調(diào)控miR-222的分子通路，筆者等采用生物信息學(xué)、Western印跡和qPCR等方法，對MSTN通過MEF2C調(diào)控miR-222的分子通路進行研究，以期為后續(xù)研究脂肪沉積提供有力依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

野生型PK15 細(xì)胞，由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所/動物胚胎工程及分子育種湖北省重點實驗室研究保存提供；PK3108細(xì)胞系PK15細(xì)胞上成功敲除MSTN后所得[14]。單核苷酸鏈及試驗所用引物由武漢天一輝遠公司合成。胎牛血清和DMEM 高糖培養(yǎng)基，購自Gibco 公司。BCA 蛋白定量試劑盒和SDSPAGE凝膠配置試劑盒，購于碧云天生物技術(shù)有限公司；TRIzol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和4 × SDS loading buffer(Invitrogen)、2 × SYBR Green Mix 和RNase free water(TaKaRa,中國大連)，購自寶生物工程(大連)有限公司；MEF2C 抗體，購于美國Abcam公司。PCR 儀購買于LifeTechnology(美國) 公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 生物信息學(xué)預(yù)測MEF2C靶向miR-222啟動子區(qū)域結(jié)合位點 采用Promo、JASPAR在線預(yù)測MEF2C在miR222啟動子區(qū)域的結(jié)合位點。

1.2.2 Western blot印跡和qPCR

1) Western印跡檢測野生型PK15(MSTN+/+)和PK3108(MSTN+/-)細(xì)胞系中MEF2C的表達量變化。收集PK15細(xì)胞、PK3108細(xì)胞，提取細(xì)胞的總蛋白。BCA法測定蛋白濃度，取20 μL樣品，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳時濃縮膠恒壓80V、30 min，分離膠恒壓120V、70 min。轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗4℃過夜，二抗室溫孵育2 h，DAB化學(xué)顯色并分析結(jié)果。

2) MSTN敲除后qPCR檢測PK15(MSTN+/+)、PK3108(MSTN+/-)細(xì)胞系中miR-222的表達量變化?？俁NA提?。簵壢ヅ囵B(yǎng)液，DPBS清洗3遍后收集細(xì)胞至1.5 mL離心管中，加800 μL Trizol裂解細(xì)胞并反復(fù)吹打至無明顯沉淀，靜置5 min，加入160 μL氯仿(Trizol體積的1/5)，上下顛倒數(shù)次混勻，靜置10 min，12 000 g、4℃離心10 min。吸取上清200 μL至新的EP管中并加入等體積異丙醇，靜置10 min，12 000 g、4℃離心10 min。棄去上清，加入800 μL 75%乙醇清洗沉淀，輕輕顛倒數(shù)次，8 000 g、4℃離心5 min。棄去上清，打開蓋子待乙醇揮發(fā)后加入30 μL DEPC水溶解并測濃度。

RT-qPCR檢測miR-222表達量變化：設(shè)計莖環(huán)引物(表1)對其進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(SYBR Green Assay)：Temlpate RNA，1 μg，Gene-specific primer(莖環(huán)引物)，1 μL；5×Reaction Buffer，4 μL，RiboLock RNase Inhibitor(20U/μL)，1 μL；10 mM dNTP Mix，2 μL，RevertAid M-MuLV RT(200U/μL)，1 μL，加ddH2O補足至 20 μL；逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：42℃，60 min；70℃，5 min。qPCR檢測miR-222表達體系：cDNA，1 μL，SYBR Green，10 μL，上、下游引物(表1)，1 μL；加ddH2O 補足至20 μL；反應(yīng)體系條件：95℃、30 s預(yù)變性；95℃、10 s變性，60℃、30 s退火，共40個循環(huán)。以U6作為內(nèi)參基因，通過2-ΔΔCt評價miRNA的表達水平。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 RT-qPCR primer sequence

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用Excel對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計，并用spss18.0進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物信息學(xué)結(jié)合位點預(yù)測結(jié)果

通過在線分析軟件分析，結(jié)果(圖1A)表明，在ssc-miR-222啟動子區(qū)域存在MEF2C的多個結(jié)合位點，初步判斷MEF2C對miR-222可能存在調(diào)控作用。圖1B為MEF2C在miR-222啟動子區(qū)域結(jié)合位點示意圖。

2.2 Western印跡檢測 MEF2C表達量變化

Western印跡檢測結(jié)果(圖2)表明，當(dāng)PK15(MSTN+/+)敲除MSTN后，所獲得的PK3108(MSTN+/-)細(xì)胞中的MEF2C表達量高于PK15(MSTN+/+)細(xì)胞中的表達量，即PK15(MSTN+/+)敲除MSTN后MEF2C表達量呈增高趨勢。說明MSTN敲除后引起MEF2C表達量上升。

圖1 MEF2C在miR-222啟動子區(qū)域的結(jié)合位點預(yù)測Fig.1 Prediction of binding sites of MEF2C in miR-222 promoter region

圖2 MEF2C 在 PK15(MSTN+/+)和 PK3108(MSTN+/-)細(xì)胞系中的表達量Fig.2 Expression of MEF2C in cell lines of PK15(MSTN+/+)and PK3108(MSTN+/-)

2.3 MSTN 敲除后 RT-qPCR檢測中miR-222的表達量變化

從圖3看出，當(dāng)PK15(MSTN+/+)敲除MSTN后，所獲得的PK3108(MSTN+/-)細(xì)胞中的miR-222的表達量高于PK15(MSTN+/+)細(xì)胞中的表達量，PK3108(MSTN+/-)細(xì)胞中的miR-222表達量比PK15(MSTN+/+)高3.48倍(P<0.01)，即PK15(MSTN+/+)敲除MSTN后MEF2C表達量增高，而MEF2C高表達促進miR-222表達量上調(diào)，上調(diào)幅度達3.48倍。

圖3 PK15(MSTN+/+)和 PK3108(MSTN+/-)細(xì)胞系中 miR-222的表達量Fig.3 Expression of miR-222 in cell lines of PK15(MSTN+/+)and PK3108(MSTN+/-)

3 結(jié)論與討論

本研究通過生物信息學(xué)的方法預(yù)測到在 miR-222 啟動子區(qū)域存在有多個 MEF2C 結(jié)合位點，Western 印跡結(jié)果顯示，MSTN敲除后MEF2C表達量升高。在轉(zhuǎn)錄水平上，MSTN敲除后miR-222 的表達量也呈上升趨勢，當(dāng)PK15(MSTN+/+)敲除MSTN后，所獲得的PK3108(MSTN+/-)細(xì)胞中miR-222表達量較PK15(MSTN+/+)高。即PK15(MSTN+/+)敲除MSTN后其MEF2C表達量增高，而MEF2C高表達促進miR-222表達量上調(diào)，上調(diào)幅度達3.48倍。因此推測，動物體內(nèi)的脂肪沉積可能與 MEF2C 和miR-222有關(guān)。這與LU J等[8]采用慢病毒介導(dǎo)的 RNA 干擾沉默MSTN表達后MEF2C 表達上調(diào)的研究結(jié)果一致。另有國外學(xué)者在探索硬脂酰輔酶A去飽和酶5(SCD5)在黑色素瘤中的表達機制時發(fā)現(xiàn)，SCD5和miR-222之間存在負(fù)反饋回路[15]，而SCD5的表達量與脂肪沉積又有直接關(guān)系，表明研究脂肪沉積的分子通路與SCD5關(guān)系密切。

綜合上以研究表明，MSTN、MEF2C、miR-222與脂肪沉積有著密不可分的關(guān)系，其影響機制表現(xiàn)為：MSTN 敲除后引起 MEF2C 表達量上升，進而促進 miR-222 表達量上調(diào)。雖然，目前對MSTN影響脂肪沉積的機制有一定研究，但關(guān)于影響動物脂肪沉積的分子通路還未明確。因此，筆者等將在此研究基礎(chǔ)上繼續(xù)相關(guān)研究，以期發(fā)掘出一條影響動物脂肪沉積的分子通路，為動物選擇性育種提供參考。