羅玉英，彭麗娟，丁繼林，付 順，李 雨*

( 1.貴州省煙草公司 遵義市公司，貴州 遵義 563000；2.貴州大學(xué) 煙草學(xué)院，貴州 貴陽 550025；3.江蘇中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，江蘇 南京 210019)

煙草黑脛病(Phytophthoranicotianae)是貴州煙草生產(chǎn)上最具破壞性的土傳病害之一，每年由該病害造成的經(jīng)濟損失近千萬元，嚴(yán)重影響煙農(nóng)的經(jīng)濟收入[1-3]。目前生產(chǎn)上大多采用化學(xué)藥劑防治，其使用年限較長，病原菌抗藥性逐年增加，農(nóng)藥殘留及環(huán)境污染等負面效應(yīng)也逐步增長[4-6]。因此，采用生物農(nóng)藥進行煙草病害防治是目前研究的熱點領(lǐng)域[7-11]。

芽孢桿菌(Bacillusspp.)是當(dāng)前生物防治研究中最常用的微生物種類[12-13]，芽孢桿菌具備產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的前景，且具有作用機制多樣，生產(chǎn)成本低，易儲運，不易產(chǎn)生抗藥性，對人畜安全等優(yōu)點，是生防制劑開發(fā)的重要方向。目前國內(nèi)外已有多種性狀優(yōu)良的天然芽孢桿菌分離菌株被制成活體微生物制劑并成功商品化應(yīng)用，發(fā)展?jié)摿薮骩14-15]。Gustafson 公司研發(fā)的生物殺菌劑BioYield由解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)FZB42和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)GB122 混合制成，已被應(yīng)用于多種植物病害的防治[16]。我國最早由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)研制成由蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)和枯草芽孢桿菌等芽孢桿菌制成的增產(chǎn)菌系列產(chǎn)品，其在水稻、小麥、蔬菜和更多經(jīng)濟作物上應(yīng)用均表現(xiàn)出良好的增產(chǎn)和防病效果[17-18]。目前適宜于貴州煙草黑脛病防治的生防制劑開發(fā)及使用相對較少，許多報道證明貴州省烤煙產(chǎn)區(qū)該病害病原菌的抗藥性逐年增加[4-6]。鑒于此，從貴州省遵義市烤煙種植煙草黑脛病發(fā)病地塊采集健康煙株根際土壤，采用平板對峙法分離篩選對該病具有防治潛力的芽孢桿菌菌株，通過形態(tài)學(xué)特征、生理生化特征及16S rDNA基因序列分析對其進行鑒定，并進行田間防效試驗，旨在為煙草黑脛病生物農(nóng)藥芽孢桿菌制劑的研發(fā)提供新的生防菌資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 煙草黑脛病菌，由貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理學(xué)教研室提供。

1.1.2 土樣采集 2017年從貴州省遵義市主要烤煙種植區(qū)選取煙草黑脛病發(fā)病地塊，5點取樣法從健康煙株根際采集土壤，將同一地塊土樣混合算1份土樣。具體采集時間、地點詳見表1。土樣使用無菌自封袋收集，土壤采集工具用75%酒精進行消毒，避免不同田塊之間土壤微生物混雜。

表1 煙草黑脛病發(fā)病土樣采集信息Table 1 Information of soil samples infected with tobacco black shank

1.1.3 試劑 30%甲霜·噁霉靈水劑，中農(nóng)立華(天津)農(nóng)用化學(xué)品有限公司生產(chǎn)。

1.1.4 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、蛋白酶檢測培養(yǎng)基和纖維素酶檢測培養(yǎng)基，參照文獻[15-16]的方法配制。

1.2 方法

1.2.1 根際芽孢桿菌的分離與保存 采用稀釋平板法[19]分離，將土壤稀釋液在85℃的水浴鍋中水浴30 min以殺滅絕大部分非芽孢細菌。取100 μL稀釋液涂LB培養(yǎng)基平板，每濃度涂平板4個重復(fù)，于37℃下過夜培養(yǎng)。挑取不同的單菌落，純化菌株并保存于-80℃冰箱。

1.2.2 菌株的篩選 在PDA培養(yǎng)基上以煙草黑脛病菌為供試病原菌，通過平板對峙法[10-19]篩選防治煙草黑脛病效果明顯的生防菌株。通過初篩和復(fù)篩觀察是否產(chǎn)生抑菌圈，并利用十字交叉法測量其抑菌直徑；再通過特定平板檢測是否有生物膜、蛋白酶及纖維素酶的產(chǎn)生，選擇其中3株效果最好的菌株用于后續(xù)大田試驗。

抑菌率=[(對照組菌落直徑-處理組菌落直徑)/處理組菌落直徑]×100%

1.2.3 菌株的鑒定 參照文獻[20-24]的方法，通過形態(tài)學(xué)、生理生化特征及16S rDNA基因序列分析對篩選的菌株進行鑒定。

1) 菌落形態(tài)特征觀察。菌株接種至含有5 mL LB培養(yǎng)液的試管中，37℃過夜搖培，離心收集菌體，菌體用無菌水清洗3次，最后用無菌水重懸并稀釋至濃度1×108CFU/mL，在LB平板上滴加10 μL菌液，37℃過夜培養(yǎng)后觀察菌落形態(tài)。

2) 生理生化特征。根據(jù)《伯杰氏系統(tǒng)細菌學(xué)手冊》[22]對菌株的生理生化特性進行測定。

3) 分子生物學(xué)鑒定。50 mg/mL溶菌酶37℃水浴1 h處理菌體后，使用Biomiga細菌基因組DNA提取試劑盒提取。以基因組DNA為模板，采用16S rDNA 通用引物27F/1492R[23]進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物驗證正確后送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行PCR產(chǎn)物測序。測序結(jié)果于NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對分析，并利用CLUSTAL X軟件進行多序列比對和系統(tǒng)進化分析軟件MEGA 6中的Neighbor-Joining算法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[24]。

1.2.4 田間防效試驗

1) 供試品種。云煙87。

2) 試驗設(shè)計。設(shè)5個處理，篩選的3株芽孢桿菌(編號為MT310，MT319和MT323)分別為1個處理，以藥劑30%甲霜·噁霉靈水劑為陽性對照，未進行任何藥劑處理的為空白對照，3次重復(fù)，每小區(qū)種30株煙，所有處理隨機區(qū)組排列。藥劑處理濃度及用量參考藥劑說明，煙苗移栽時灌根施用，施用2次；芽孢桿菌濃度為 108cfu/mL，50 mL菌液灌根施用，共施用3次，煙苗移栽時第1次灌根，后每隔7～10 d灌1次。2018年4月23日移栽，田間栽培管理方法與當(dāng)?shù)匾恢?，不施用其他殺菌劑?/p>

3) 田間調(diào)查。試驗在湄潭縣抄樂鎮(zhèn)進行。試驗地肥力均勻，2017年種植烤煙且黑脛病發(fā)病地塊。選取空白對照開始發(fā)病后到采收前共進行3次，調(diào)查各小區(qū)煙株黑脛病發(fā)病情況，以空白對照小區(qū)開始發(fā)生煙草黑脛病時進行第1次調(diào)查(2018年6月26日)。依據(jù)GB/T 23222-2008進行煙草黑脛病病害分級，計算病害的發(fā)病率和病情指數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用DPS處理數(shù)據(jù)，Duncan新復(fù)極差法進行方差分析[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草根際土壤芽孢桿菌的篩選

2017—2018年從遵義烤煙主要種植區(qū)采集煙草主栽品種健康植株的根際土壤及根部組織共15份，從中分離保存芽孢桿菌562株(圖1)。其中，湄潭縣興隆鎮(zhèn)189株，鳳岡縣進化鎮(zhèn)71株，余慶縣松煙鎮(zhèn)92株，綏陽縣蒲場鎮(zhèn)50株，湄潭縣抄樂鎮(zhèn)160株。

注：A，稀釋涂板得到芽孢桿菌單菌落；B，純化菌株；C，保存菌株。Note: A, single bacillus colony obtained from dilution plate；B, purified strain；C, strain preservation.圖1 煙草根際土壤芽孢桿菌的分離Fig.1 Isolation of Bacillus strains from tobacco rhizosphere soil

2.2 煙草黑脛病菌拮抗芽孢桿菌的篩選及鑒定

2.2.1 生防芽孢桿菌篩選 以煙草黑脛病菌為供試病原菌，經(jīng)初篩與復(fù)篩得到拮抗效果較好的芽孢桿菌3株，編號為MT310、MT319和MT323(圖2)，其對煙草黑脛病菌的抑菌率分別為77.1%、79.7%和79.9%。

注：A，初篩；B，復(fù)篩；CK，煙草黑脛病菌；MT310、MT319、MT323表示篩選到的具有拮抗效果的芽孢桿菌菌株。Note: A, preliminary screening; B, secondary screening; CK，Phytophthora nicotianae；MT310, MT319 and MT323 are Bacillus strains with an antagonistic effect.圖2 生防菌株MT310、MT319 和 MT323對煙草黑脛病菌的拮抗效果Fig.2 Antagonistic effect of MT310, MT319 and MT323 biological control strains against tobacco black shank

2.2.2 生防菌株的生物膜、蛋白酶和纖維素酶測定 蛋白酶和纖維素酶均為芽孢桿菌產(chǎn)生的細胞壁降解酶，可降解大多數(shù)植物病原菌細胞壁，使其菌絲破裂死亡[25]。植物有益芽孢桿菌可在根系表面形成結(jié)構(gòu)復(fù)雜的生物膜，牢固定殖在植物根系，發(fā)揮其生防作用[14,16]。從圖3可見，MT310、MT319和MT323等3株芽孢桿菌均可產(chǎn)生較為復(fù)雜的生物膜結(jié)構(gòu)，均可產(chǎn)生蛋白酶和纖維素酶。表明，3株菌株具有潛在的定殖植物根系和降解植物病原菌細胞壁的能力。

圖3 生防菌株 MT310、MT319和 MT323的菌落形態(tài)及其生物膜、蛋白酶和纖維素酶檢測Fig.3 Colony morphology,biological membrane, protease and cellulase of MT 310, MT 319 and MT323

biological control strains

2.2.3 生防菌株鑒定 從表2可見，3株菌株均為G+，均可分解葡萄糖、鼠李糖和甘露醇，產(chǎn)生過氧化氫酶和硝酸還原酶，甲基紅染色陽性，可液化明膠等特征。將3株菌株的測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫對比，菌株MT310和MT319與解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)具有很高的同源性，達100%，菌株MT323與枯草芽孢桿菌(B.subtilis)具有很高的同源性，達100%。MT310、MT319、MT323的16S rDNA基因序列已提交GenBank數(shù)據(jù)庫，序列號分別為MK103120、MK103121和MK213735。根據(jù)16S rDNA基因序列分析構(gòu)建基因進化樹(圖4)顯示，株菌MT310和MT319與解淀粉芽孢桿菌聚在一個子分支上，MT323與枯草芽孢桿菌聚在一個子分支上，結(jié)合形態(tài)學(xué)、生理生化特性及16S rDNA基因序列分析確定MT310和MT319為解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)，MT323為枯草芽孢桿菌(B.subtilis)。

表2 生防菌株 MT310、MT319和MT323的生理生化特征Table 2 Physiological and biochemical characteristics of MT310, MT319 and MT323 biological control strains

注：+，陽性反應(yīng)；-，陰性反應(yīng)。
Note: +, positive reaction;-, negative reaction.

圖4 生防菌株MT310、MT319及MT323的16S rDNA基因進化樹Fig.4 16S rDNA gene evolutionary tree of MT310, MT319 and MT323 biological control strains

2.3 田間防效試驗

從表3可知，3株芽孢桿菌對煙草黑脛病均有一定防效(>60.0%)，但防效均不及目前生產(chǎn)中常用藥劑甲霜·噁霉靈(90.0%)的防效。其中，MT310防效最好，為70.1%；其次是MT323和MT319，分別為63.5%和60.2%，二者差異不顯著，但均與MT310差異顯著。

表3 生防菌株MT310、MT319及MT323對煙草黑脛病的田間防效Table 3 Control effect of 3 MT310,MT319 and MT323 biological control strains against tobacco black shank in field

3 結(jié)論與討論

從貴州省遵義市主要烤煙種植區(qū)，煙草黑脛病發(fā)病地塊采集健康煙株根際土壤，從中分離得到具明顯拮抗煙草黑脛病菌(P.nicotianae)能力的芽孢桿菌MT310、MT319和MT323，經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化特性及16S rDNA基因序列分析，確定菌株MT310和MT319為解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)，MT323為枯草芽孢桿菌(B.subtilis)。3株芽孢桿菌均能產(chǎn)生較為復(fù)雜的生物膜結(jié)構(gòu)，均可產(chǎn)生蛋白酶和纖維素酶。其作為生防菌劑用于田間試驗，均對煙草黑脛病具有明顯的防效(>60%)。

我國活菌制劑生物農(nóng)藥中，枯草芽孢桿菌(B.subtilis)和解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)是目前施用最多的生防芽孢桿菌，僅次于蘇云金芽孢桿菌(B.thuringiensis)[16]。芽孢桿菌可產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)抑制植物病原真菌。有研究認(rèn)為，芽孢桿菌抗真菌活性來源于非核糖體合成途徑產(chǎn)生環(huán)脂肽類抗生素，這些次生代謝產(chǎn)物可抑制菌絲生長及孢子萌發(fā)[14-16]。該研究分離到3株芽孢桿菌均產(chǎn)生蛋白酶和纖維素酶，可能是其抑制煙草黑脛病病原菌(P.nicotianae)的機制之一，對于其他可能的生防機制有待進一步研究。

2018年湄潭縣抄樂鎮(zhèn)6—8月降雨較少，不適宜病害發(fā)生與流行。因此，試驗地塊煙草黑脛病發(fā)病較輕，較有利于生防菌劑防治效果的發(fā)揮。3株芽孢桿菌均對煙草黑脛病具明顯防效，但與甲霜·噁霉靈比較，防效相對較差，田間施用次數(shù)多1次。有報道表明，生產(chǎn)中煙草黑脛病菌已對甲霜靈·錳鋅產(chǎn)生抗藥性[4-6]。因此，結(jié)合化學(xué)藥劑和生物殺菌劑的優(yōu)缺點，可嘗試生防菌株與化學(xué)農(nóng)藥復(fù)配施用，以達到減少化學(xué)農(nóng)藥用量的目的。下一步還將繼續(xù)尋找貴州生態(tài)區(qū)域和種植模式下的拮抗芽孢桿菌(Bacillusspp.)，并研究開發(fā)生物制劑，以減少農(nóng)藥使用和農(nóng)藥殘留，保障貴州煙草的綠色生產(chǎn)。