劉小胖，張 寧*，李炳學(xué)

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，遼寧 沈陽 110161；2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 土地與環(huán)境學(xué)院，遼寧 沈陽 110161)

淀粉酶是自然界中廣泛存在的一種水解酶類，主要應(yīng)用于食品加工、醫(yī)藥、化工領(lǐng)域。目前，淀粉酶占世界所有酶產(chǎn)量的30%[1]。自然界中有許多微生物都能夠產(chǎn)生淀粉酶，如曲霉屬[2-3]和芽孢桿菌[4-5]。市場上的許多淀粉酶都來自于微生物的發(fā)酵生產(chǎn)[6]，而以枯草桿菌為工業(yè)化生產(chǎn)主導(dǎo)菌株。國外已先后從黑曲霉[7]、擔(dān)子菌酵母[8]獲得了該基因的cDNA或DNA片段并在體外進行了功能驗證。國內(nèi)學(xué)者先后從地衣芽孢桿菌[9]、解淀粉酶芽孢桿菌[10]、枯草芽孢桿菌[11]和極端嗜熱厭氧古菌[12]中獲得了該酶基的cDNA或DNA片段并在體外驗證了功能。關(guān)于出芽短梗霉產(chǎn)淀粉酶，LEATHERS[13]研究發(fā)現(xiàn)，在不同的碳源上，出芽短梗霉可產(chǎn)生α-淀粉酶；CATHY[14]研究在出芽短梗霉中α-淀粉酶可以使普魯蘭糖的分子量和粘度降低；LINARDI等[15]研究發(fā)現(xiàn)，α-淀粉酶是普魯蘭多糖分子降解的主要酶類；POLLOCK等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)后期普魯蘭糖的分子量降低，這可能是由于菌體在培養(yǎng)基中分泌了α-淀粉酶。MANITCHOTPISIT等[17-18]研究發(fā)現(xiàn)，在出芽短梗霉產(chǎn)普魯蘭糖的后期，α-淀粉酶可以使普魯蘭糖的分子量降低且起明顯的作用，在培養(yǎng)基中添加淀粉酶抑制劑可使普魯蘭多糖保持在高分子量范圍內(nèi)。WANG等[19]研究發(fā)現(xiàn)，添加氯化鈉使出芽短梗霉產(chǎn)普魯蘭多糖的產(chǎn)量提高，但分子量降低，氯化鈉使α-淀粉酶的活性和基因的表達量均有所提高。在國內(nèi)，王曉紅等[20]第1次發(fā)現(xiàn)出芽短梗霉也可產(chǎn)生α-淀粉酶；LI等[21]從海洋中分離1株出芽短梗霉可以產(chǎn)生淀粉酶并且可以降解生土豆淀粉[22]；李海峰等[23-24]從海洋中分離得到1株可以產(chǎn)淀粉酶的普魯蘭類酵母，且降解α-1,6糖苷鍵的能力很強。但早期國內(nèi)外對出芽短梗霉產(chǎn)生淀粉酶的研究尚少[25]。出芽短梗霉是普魯蘭多糖的主要生產(chǎn)菌株[26]，普魯蘭多糖作為一種重要的商業(yè)化多糖，在工業(yè)、食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域都有廣泛應(yīng)用，但是其機理目前尚不清楚。筆者所在課題組通過研究轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，在高產(chǎn)普魯蘭糖時α-淀粉酶基因顯著上調(diào)，推測其可能和普魯蘭多糖的合成緊密相關(guān)。因此，采用反轉(zhuǎn)錄方法結(jié)合PCR技術(shù)克隆出芽短梗霉α-淀粉酶基因并對該基因進行生物信息學(xué)分析，為以后的體外功能驗證奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 出芽短梗霉NG 出芽短梗霉NG(AureobasidiumpullulansNG)由沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)土地與環(huán)境學(xué)院微生物實驗室保存。

1.1.2 試劑 核酸Marker、加A試劑盒、pMD-18T連接試劑盒、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞(保存于-80℃)；T4-連接酶、Primer Star聚合酶、RNAiso Plus試劑、限制性核酸內(nèi)切酶BglII和EcoRI、實時定量反轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、總RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時定量SYBR試劑盒、膠回收試劑盒(大連寶生物公司)，瓊脂糖(北京天根)，葡萄糖、酵母浸粉、蛋白胨、硝酸鈉、磷酸二氫鉀、硫酸鎂(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)，PCR引物合成與測序(上海生物工程有限公司)。

1.1.3 培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基[27](YND，g/L)：葡萄糖20、NaNO36.4、酵母浸粉0.2、KH2PO41.0，MgSO4·7.H2O 0.5，pH 6.0±0.5；產(chǎn)糖培養(yǎng)基[28](YPD，g/L)：葡萄糖20、蛋白胨20、酵母粉10，pH6.0±0.5。以上培養(yǎng)基，固體培養(yǎng)基均加2%的瓊脂粉。

1.2 出芽短梗霉總RNA的提取及cDNA的合成

將保藏有菌株的PDA斜面放于28℃活化24 h，然后挑取菌種接于土豆培養(yǎng)基(PDA)平板上活化，挑取單菌落接種到Y(jié)ND液體培養(yǎng)基中，按180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h成為預(yù)種子液，再以體積比1%的接種量接種到Y(jié)ND液體培養(yǎng)基，180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h成為種子液。將種子液按1%的量加入到50 mL的YPD培養(yǎng)基中，180 r/min、28℃條件下培養(yǎng)3 d。參照總RNA提取試劑盒說明書提取出芽短梗霉菌齡3 d的總RNA，使用微量分光光度計Nano Drop測定所提取RNA的純度及濃度，1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的提取質(zhì)量。選取提取質(zhì)量較好的即具有2條明亮條帶的RNA進行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后用于目的基因的克隆。

1.3 出芽短梗霉α-淀粉酶基因cDNA序列的獲得

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)設(shè)計1對引物，F(xiàn)-BglII: 5′-GAAGATCTATGGCTTCATGGCTGCGCAG-3′、R-EcoRI: 5′-CGGAATTCTCATTGCATGGTGAACTTTC-3′。通過PCR擴增出芽短梗霉α-淀粉酶基因的ORF區(qū)(開放閱讀框)。在20 μL反應(yīng)體系：cDNA模板1.0 μL，Primerstar高保真酶10 μL，上下游引物各0.5 μL，ddH2O 8 μL。擴增條件：94℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，58.7℃退火30 s，72℃延伸2 min，34個循環(huán)；72℃再延伸10 min，12℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，片段大小正確后目的片段進行膠回收，得到出芽短梗霉α-淀粉酶基因cDNA序列，對片段進行加A反應(yīng)，然后連接pMD-18T載體，16℃過夜，轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細胞中，涂布于含有Amp抗生素(50 μg/mL)的LB固體培養(yǎng)基上進行陽性克隆的篩選，挑取單菌落進行菌落PCR驗證，將菌落PCR驗證為陽性轉(zhuǎn)化子的菌落進行擴大培養(yǎng)提取質(zhì)粒再次進行PCR驗證，最后將菌落PCR和質(zhì)粒PCR驗證均為陽性轉(zhuǎn)化子的菌液送上海生工測序。

1.4 出芽短梗霉α-淀粉酶基因的生物信息學(xué)分析

利用克隆得到的序列，比對轉(zhuǎn)錄組序列驗證PCR產(chǎn)物序列的正確性。利用DNAMAN推導(dǎo)α-淀粉酶基因的氨基酸序列。利用NCBI上的Blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)同源性分析并用MEGA 5.1軟件中的鄰近法(Neighbor-Joining,NJ)構(gòu)建α-淀粉酶基因系統(tǒng)發(fā)育樹[29]。利用ProtParam工具(http://web.expasy.org/protparam/)分析α-淀粉酶的基本理化性質(zhì)；利用SignalP4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析α-淀粉酶的信號肽剪切位點，利用S-score的值用Signal IP 4.0軟件判斷是否存在信號肽，若S-score>0.5，說明存在信號肽[30]；C-score 代表剪切位點值；Y-max score結(jié)合S和C值判斷信號肽切割位點[31]；利用Smart[32](http://smart.embl-heidilberg.de/)預(yù)測α-淀粉酶氨基酸序列的保守結(jié)構(gòu)域；利用MPRED(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form．html)和TMHMM2.0[33](http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)α-淀粉酶蛋白序列的跨膜區(qū)域分析；利用ProtScale(http://web.expasy.org/protscale/)進行α-淀粉酶氨基酸序列的疏水性分析，若預(yù)測結(jié)果得分大于0，且分值越大表明疏水性越強；若得分小于0，且分值越小表明親水性越強；通過OPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)預(yù)測α-淀粉酶氨基酸的二級結(jié)構(gòu)；通過SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)預(yù)測α-淀粉酶氨基酸的三級結(jié)構(gòu)。

1.5 普魯蘭多糖粘度的測定

將種子液接種到Y(jié)PD培養(yǎng)基中，從24 h開始，每隔24 h取樣1次，將菌液按5 000 r/min離心10 min，將上清置于燒杯中，加入2倍體積的無水乙醇，4℃過夜，按8 000 r/min離心10 min，將沉淀用蒸餾水重新溶解，再次加入2倍體積的無水乙醇，4℃過夜，按8 000 r/min離心10 min，將沉淀置于80℃烘箱中烘干至恒重，將多糖沉淀研磨至粉末狀，稱取一定質(zhì)量的多糖溶解于去離子水中，配置成1%的多糖溶液，0.22 μm的微孔濾膜過濾，25℃下用粘度計測量其粘度變化。

1.6 普魯蘭多糖產(chǎn)量的測定[34]

取20 mL的菌液5 000 r/min離心10 min，取上清液10 mL加入2倍體積的無水乙醇，4℃靜置過夜，8 000 r/min離心10 min，收集沉淀，加水重溶，再次加入2倍體積的無水乙醇進行沉淀，將沉淀于80℃烘干至恒重。每組重復(fù)3次。

1.7 出芽短梗霉中α-淀粉酶基因表達的分析

將出芽短梗霉的種子液以1%接種量加入到50 mL的YPD培養(yǎng)基中，從24 h開始，每隔12 h取樣1次，至108 h止。利用RNAiso Plus試劑提取出芽短梗霉的總RNA[35]，并利用實時定量反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，操作方法參照試劑盒說明書。18S作為內(nèi)參基因，使用的儀器是美國伯樂公司的CFX ConnectTM熒光定量PCR儀?；虻南鄬Ρ磉_量公式為R=2-ΔΔCt。結(jié)果進行單因素方差分析(ANOVA )[36]，T檢驗比較數(shù)據(jù)間的差異是否顯著(P<0.05認為具有顯著性差異)，每個樣品重復(fù)3次。利用Primer 5.0設(shè)計引物(表1)，并由上海生物工程公司合成。

表1 PCR引物信息Table 1 Information of PCR primers

2 結(jié)果與分析

2.1 出芽短梗霉總RNA的提取

用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的提取效果(圖1)，結(jié)果有18S rRNA和28S rRNA 2條清晰的條帶，說明提取的總RNA純度較高，可以滿足后續(xù)試驗的要求。

圖1 出芽短梗霉總RNAFig.1 Total RNA extracted from A.pullulans

2.2 出芽短梗霉α-淀粉酶基因全長cDNA的克隆

通過F-BglII、R-EcoRI在出芽短梗霉cDNA上，成功克隆了出芽短梗霉α-淀粉酶基因全長cDNA序列，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，產(chǎn)物條帶單一明亮(圖2)，表明引物特異性強，可以進行條帶膠回收并進行下一步試驗。

2.3 出芽短梗霉中α-淀粉酶基因的生物信息

2.3.1 系統(tǒng)發(fā)育樹 利用NCBI 上的BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)獲得大量與出芽短梗霉α-淀粉酶氨基酸序列的同源序列，但在進行Blast時發(fā)現(xiàn)，其與其他菌α-淀粉酶的同源性為50%～60%，卻與glucan 1,4-alpha-maltohexaosidase precursor(登錄KEQ67332.1)有極高的相似性，進化樹上也與其親緣關(guān)系較近(圖3)。

注：M為2 000 的marker; 1為CK ;2～3 為α-淀粉酶基因。Note: M, marker DL 2 000; 1, CK; 2～3, α-amylase gene.圖2 出芽短梗霉α-淀粉酶基因全長克隆Fig.2 Full-length cloning of α-amylase gene from A.pullulans

注：進化樹分支置信度檢測利用 Bootstrap 進行(1 000次)，分支上數(shù)值表示置信度。Note: The confidence of cladogram’ branches is tested by bootstrap analyses ( 1 000 replicates).The value on the branch indicates the confidence.圖3 α-淀粉酶蛋白的氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic tree based on amino acid sequences of α-amylase protein from A.pullulans

2.3.2α-淀粉酶蛋白潛在的信號肽切割位點 由圖4表明，在出芽短梗霉中α-淀粉酶基因編碼的氨基酸序列中沒有信號肽剪切位點。

2.3.3α-淀粉酶理化性質(zhì) 該蛋白具有563個氨基酸，分子量為63 318.63 Da，理論等電點(pI)為7.24；在組成出芽短梗霉中α-淀粉酶的20種氨基酸當中，丙氨酸(Ala)含量占比最高，達8.7%；而半胱氨酸(Cys)含量最低，為1.4%；帶負電荷氨基酸殘基數(shù)(天冬氨酸和谷氨酸)有67個，帶正電荷氨基酸殘基數(shù)(精氨酸和賴氨酸)也有67個。出芽短梗霉中α-淀粉酶基因編碼多肽的原子組成為C2845H4317N789O817S21，原子總數(shù)為8 789，消光系數(shù)在280 nm下為157 830。出芽短梗霉中α-淀粉酶的不穩(wěn)定系數(shù)為32.24，由此說明該蛋白是穩(wěn)定的蛋白。預(yù)測該蛋白的脂肪系數(shù)為68.97，α-淀粉酶的總平均親水性為-0.490，說明該蛋白為親水性的蛋白。

圖4 α-淀粉酶信號肽的酶切位點Fig.4 Restriction enzyme cutting sites of α-amylase signal peptide

2.3.4α-淀粉酶親疏水性 如圖5所示，蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)域大多數(shù)由約20個疏水性氨基酸殘基組成的α螺旋結(jié)構(gòu)。該氨基酸序列內(nèi)含有較多的親水性結(jié)構(gòu)域，表明出芽短梗霉中α-淀粉酶基因編碼蛋白可能為親水性蛋白。結(jié)合出芽短梗霉中α-淀粉酶的親/疏水性、脂肪系數(shù)與總平均親水性來綜合分析，由此可以判定α-淀粉酶是親水性蛋白，這與CATLEY[14]研究發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基上清中α-淀粉酶可以使普魯蘭多糖分子量降低一致，說明在菌體內(nèi)α-淀粉酶是分泌蛋白，此預(yù)測與體內(nèi)的結(jié)果一致。

出芽短梗霉中α-淀粉酶基因編碼的氨基酸疏水性較差(圖5)，不存在典型的強疏水性結(jié)構(gòu)域，從而可判斷α-淀粉酶基因編碼的蛋白質(zhì)不存在跨膜區(qū)域，即出芽短梗霉中α-淀粉酶基因編碼的蛋白質(zhì)不是跨膜蛋白。

2.3.5α-淀粉酶跨膜螺旋結(jié)構(gòu) 由圖6A可見，α-淀粉酶基因編碼的蛋白質(zhì)含有多個跨膜螺旋區(qū)域，其中由外向內(nèi)有4個跨膜螺旋區(qū)域，這4個螺旋區(qū)域相應(yīng)的氨基酸位置為第65～86個(分數(shù)683)、第130～148個(分數(shù)59)、第419～438個(分數(shù)104)、第482～501個(分數(shù)613)，由內(nèi)向外有2個跨膜螺旋區(qū)域，其相應(yīng)的氨基酸位置為第65～86個(分數(shù)340)、第478～501個(分數(shù)683)。評分大于500認為是可能的跨膜區(qū)域[37]。綜合內(nèi)外雙向的分析，α-淀粉酶無跨膜區(qū)域。此外，由圖6B可見，出芽短梗霉中α-淀粉酶基因編碼的蛋白質(zhì)無跨膜結(jié)構(gòu)域，整段序列均位于質(zhì)膜的外側(cè)。2種在線軟件的預(yù)測結(jié)果一致，說明α-淀粉酶基因編碼的蛋白質(zhì)無跨膜結(jié)構(gòu)域，進一步證明通過疏水性分布圖(圖5)判斷蛋白質(zhì)跨膜區(qū)的可靠性，預(yù)測結(jié)果表明，α-淀粉酶基因編碼的蛋白質(zhì)不是內(nèi)在膜蛋白，而很有可能是可溶性蛋白。

圖5 α-淀粉酶編碼的氨基酸疏水性Fig.5 Hydrophobicity of α-amylase amino acids

圖6 α-淀粉酶的跨膜區(qū)域Fig.6 Transmembrane domains of α-amylase

2.3.6α-淀粉酶的保守結(jié)構(gòu)域 由圖7和表2可見，在47～453個氨基酸存在淀粉酶結(jié)構(gòu)域。

圖7 α-淀粉酶的保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig.7 Prediction for conserved domain of α-amylase

表2 α-淀粉酶基因上的其他保守結(jié)構(gòu)域Table 2 Other conserved domains in α-amylase gene

2.3.7α-淀粉酶蛋白的二級結(jié)構(gòu) 如圖8所示，α-淀粉酶蛋白的二級結(jié)構(gòu)組成中，h占27.35%，e占20.60%，t占4.62%，c占47.42%。由此可推測，出芽短梗霉中α-淀粉酶含有大量無規(guī)則卷曲和α-螺旋結(jié)構(gòu)元件，而結(jié)構(gòu)元件延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角則散布于整個蛋白質(zhì)中。

注：h代表α-螺旋、t代表β-轉(zhuǎn)角、e代表延伸鏈、c代表無規(guī)則卷曲。Note: h, α-helix; t, β-turn; e, extended strand; c, random coil.圖8 α-淀粉酶的二級結(jié)構(gòu)Fig.8 Secondary structure of α-amylase

2.3.8α-淀粉酶結(jié)構(gòu)域的三級結(jié)構(gòu) 經(jīng)SWISS-MODEL預(yù)測，三級結(jié)構(gòu)中無復(fù)雜的螺旋結(jié)構(gòu)(圖9)。

圖9 α-淀粉酶蛋白結(jié)構(gòu)域的三級結(jié)構(gòu)Fig.9 Tertiary structure of α-amylase protein structural domain

2.4 α-淀粉酶基因的氨基酸序列

由圖10可見，α-淀粉酶基因全長cDNA 序列為1 782 bp，開放閱讀框區(qū)域含有1 692 bp，共編碼563個氨基酸。

注：圖中陰影部分是α-淀粉酶功能區(qū)。Note: The shaded area is the functional zone of α-amylase.圖 10 α-淀粉酶基因的氨基酸序列Fig.10 Amino acid sequence of α-amylase gene

2.5 普魯蘭多糖的粘度

一般情況下，高分子溶液的粘度變化，一方面是由于其分子量變化，而導(dǎo)致粘度變化，普魯蘭多糖的分子量和粘度在一定條件下呈相關(guān)性 。從圖11看出，隨著普魯蘭多糖粘度的降低，普魯蘭多糖的分子量亦逐漸降低。

圖 11 普魯蘭多糖粘度的變化規(guī)律Fig.11 Change rule of pullulan viscosity

2.6 普魯蘭多糖的產(chǎn)量

如圖12所示，普魯蘭多糖的產(chǎn)量一直增加，第108 h時普魯蘭多糖產(chǎn)量達到最高。

圖 12 普蘭多糖產(chǎn)量的變化規(guī)律Fig.12 Change rule of pullulan yield

2.7 α-淀粉酶基因的實時定量分析

如圖13所示，α-淀粉酶基因在出芽短梗霉各個階段中均有表達，α-淀粉酶基因在出芽短梗霉培養(yǎng)的不同時間存在表達特異性，其中108 h的表達量最高且遠高于前期的表達量。這與前人研究的結(jié)果相吻合[17]，普魯蘭糖在發(fā)酵后期分子量降低[38]，由此可推斷出芽短梗霉中α-淀粉酶基因可能參與了普魯蘭糖分子量降解這一生物學(xué)過程。這與生物信息學(xué)分析的出芽短梗霉中α-淀粉酶非膜蛋白相吻合。

圖 13 不同時間段α-淀粉酶基因的相對表達量Fig.13 Relative expression of α-amylase gene in different time periods

3 結(jié)論與討論

該試驗采用反轉(zhuǎn)錄PCR結(jié)合普通PCR技術(shù)從出芽短梗霉克隆得到α-淀粉酶基因，生物信息學(xué)分析表明，其全長1 782 bp，包括1 692 bp編碼區(qū)序列，該基因編碼的蛋白含有563個氨基酸。多種軟件預(yù)測分析表明，該蛋白是親水性蛋白，分子量約為63.32 kDa，理論等電點(pI)為7.24；無信號肽剪切位點，無明顯的跨膜螺旋拓撲結(jié)構(gòu)，二級結(jié)構(gòu)主要以無規(guī)則卷曲為主，占47.42%。基因表達分析表明，α-淀粉酶基因在各個時期均有表達，在108 h表達量最高。該基因具有α-淀粉酶結(jié)構(gòu)域，但在進行Blast時發(fā)現(xiàn)，與其他菌α-淀粉酶的同源性為50%～60%，卻與glucan 1,4-alpha-maltohexaosidase precursor(登錄KEQ67332.1)有極高的相似性，進化樹上也與其親緣關(guān)系較近。

該研究雖然對出芽短梗霉中α-淀粉酶基因進行了克隆、生物信息學(xué)分析及基因表達分析，但其實際結(jié)構(gòu)和功能還有待進一步驗證。α-淀粉酶基因結(jié)構(gòu)簡單而且是親水蛋白，這為體外克隆表達此蛋白奠定了理論基礎(chǔ)。由于淀粉酶在實踐中的重要性，組建α-淀粉酶高產(chǎn)菌株已成為基因工程研究中的重要課題，國內(nèi)外關(guān)于這方面的研究自20世紀80年代以來進展較快。解淀粉芽孢桿菌[39]、枯草芽孢桿菌[40]、地衣芽孢桿菌[41]、黑曲霉[7]等的α-淀粉酶基因已相繼被克隆，并在大腸桿菌或枯草桿菌中得到表達。目前關(guān)于出芽短梗霉中α-淀粉酶的體外克隆表達尚未有報道，MANITCHOTPISIT等[42]分析的出芽短梗霉中淀粉酶基因與該菌株中的α-淀粉酶基因序列相差甚大，故有待于進一步驗證其功能。LIU等[42]利用基因敲除等手段研究Aureobasidium melanogenum P16 發(fā)現(xiàn)，α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、異普魯蘭酶決定了普魯蘭多糖的分子量。目前關(guān)于出芽短梗霉中α-淀粉酶的研究主要集中在酶活性上，但機理研究卻很少，故下一步欲利用分子生物學(xué)手段，將其克隆到表達載體上進行體外的功能驗證，為后續(xù)的體內(nèi)功能驗證奠定基礎(chǔ)。

有研究發(fā)現(xiàn)，α-淀粉酶在普魯蘭分子量降低過程中發(fā)揮著重要作用[17-18]。在整個搖床培養(yǎng)過程中，普魯蘭多糖的粘度一直在降低，但普魯蘭多糖的產(chǎn)量卻一直升高，α-淀粉酶的基因在108 h的搖床培養(yǎng)過程中一直表達。LIU等[42]研究發(fā)現(xiàn)，將α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、異普魯蘭酶其中任何一個基因敲除或?qū)?個基因都敲除，普魯蘭分子量升高但產(chǎn)量降低。土地與環(huán)境學(xué)院微生物實驗室在進行轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析時發(fā)現(xiàn)，在高產(chǎn)普魯蘭多糖時，在淀粉和蔗糖代謝途徑中糖代謝相關(guān)基因僅有α-淀粉酶的表達量顯著上調(diào)，推測α-淀粉酶在普魯蘭糖的合成過程中發(fā)揮著重要作用，但也待進一步探索，這可能對揭示普魯蘭多糖的合成機理發(fā)揮重大作用。