王向鵬，左百樂，王冠玉，陳園坤，楊安鋼，2

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學院醫(yī)學檢驗學院 河南省分子診斷與醫(yī)學檢驗技術協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.空軍軍醫(yī)大學基礎醫(yī)學院免疫學教研室，陜西 西安 710032)

嵌合抗原受體修飾T細胞(chimeric antigen receptor modified T cell，CAR-T)免疫療法是一種細胞治療技術，其原理是通過分離培養(yǎng)患者自身T細胞，利用基因工程技術改造T細胞，使其表達可以識別腫瘤細胞且同時可以激活T細胞的嵌合抗體，將改造后的T細胞(即CAR-T)經體外擴增后再回輸?shù)交颊唧w內，通過CAR-T表面表達的抗體特異性識別腫瘤細胞，同時激活下游信號通路，使CAR-T在體內活化、增殖，從而實現(xiàn)對腫瘤細胞的特異性殺傷。該技術自1989年由GROSS等[1]首次提出，至今已經歷了30 a的發(fā)展。2011年美國賓夕法尼亞大學JUNE教授利用CAR-T技術，以CD19分子為靶點成功治愈了晚期慢性B淋巴細胞白血病患者，自此開創(chuàng)了CAR-T治療腫瘤的新紀元[2]。2017年8月30日，美國食品藥品管理局(food and drug administration，F(xiàn)DA)首次批準諾華公司的CTL019(Kymriah)用于治療兒童和年輕成人急性淋巴細胞白血病。同年10月，美國FDA宣布批準了Kite Pharma公司的Yescarta (axicabtagene ciloleucel)上市，用于治療罹患特定類型的成人大B細胞淋巴瘤，這是全球第2個獲批的CAR-T療法。這2種CAR-T療法的上市，標志著血液系統(tǒng)惡性腫瘤治療新時代的到來[3]。

鑒于CAR-T治療技術在血液系統(tǒng)惡性腫瘤治療方面的重大突破，許多學者將CAR-T技術用于實體腫瘤的治療。由于實體腫瘤的特殊性，CAR-T免疫療法治療實體腫瘤的療效并不像治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤一樣理想；但是，越來越多的研究證實，CAR-T也可以用于實體腫瘤的治療[4]。本文對CAR-T免疫療法在實體腫瘤治療領域的研究現(xiàn)狀進行綜述，同時對其研究趨勢進行展望。

1 嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor,CAR)的結構

典型的CAR結構包括1個細胞外腫瘤相關抗原結合區(qū)、1個鉸鏈區(qū)、1個跨膜區(qū)和1個胞內信號區(qū)。細胞外腫瘤相關抗原結合區(qū)一般是靶向腫瘤相關抗原的單鏈可變片段(single chain variable fragment，scFv)，而scFv決定了CAR-T的特異性。鉸鏈區(qū)序列一般來源于免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)G1、IgG4、IgD 和CD8分子的鉸鏈區(qū)，其大小會影響scFv的靈活性?？缒^(qū)一般來自T細胞的CD3ζ、CD4、CD8、CD28分子的跨膜區(qū)序列。胞內信號區(qū)的主要作用是激活T細胞，常用的分子為CD3ζ、CD28、CD27、4-1BB(CD137)、OX40(CD134)等分子的胞內區(qū)序列。自1989年GROSS等[1]設計出第1代CAR到現(xiàn)在，該技術已經歷了4代革新。第1代CAR只有1個胞內信號分子，最常用的是CD3ζ的胞內片段，由于缺少共刺激分子，其轉導細胞增殖的信號有限，因此，對腫瘤細胞的殺傷效果并不十分理想。第2代CAR增加了共刺激分子，如CD28、4-1BB和OX40等，由于存在共刺激信號，CAR-T可以充分活化，顯著提高了對腫瘤細胞的殺傷能力。目前，第2代CAR基本上可以滿足臨床需要。第3代CAR在第2代CAR的基礎上增加了1個共刺激信號，由于胞內區(qū)有2個共刺激信號分子，CAR在體內的增殖能力和對腫瘤細胞的殺傷力又得到了進一步提高。第4代CAR是在第3代CAR的基礎上增加了促炎性細胞因子或共刺激分子的配體，其可以招募其他細胞因子進而放大局部腫瘤的免疫效應，主要用于實體腫瘤的治療[5]。

2 實體腫瘤靶點的選擇

CAR-T治療實體腫瘤面臨的首要挑戰(zhàn)是靶點的選擇。理想的靶點是只在腫瘤細胞表面表達，而在其他細胞中不表達。CAR-T在血液系統(tǒng)惡性腫瘤治療中取得了非常理想的療效，很重要的原因之一是血液腫瘤細胞有特異性的靶點，如CD19分子。實體腫瘤細胞特異性靶點較少，目前應用的實體腫瘤靶點在腫瘤細胞中表達相對較高，但在正常組織中也有表達，CAR-T在殺傷腫瘤細胞的同時，不可避免地會對正常細胞造成損傷。盡管如此，越來越多的針對實體腫瘤靶點的CAR-T療法已經開展，并取得了一定療效。ZHANG等[6]制備了針對癌胚抗原(carcino-embryonic antigen，CEA)的CAR-T，對10例CEA陽性的結直腸癌患者注射不同劑量的CAR-T，其中7例患者病情趨于穩(wěn)定，2例患者病情穩(wěn)定期超過30周，2例患者腫瘤體積明顯縮小。也有學者通過靶向雙唾液酸神經節(jié)苷脂(disialoganglioside，GD2)治療腦膠質瘤和神經母細胞瘤患者。MOUNT等[7]制備了針對GD2的CAR-T，體外實驗證明其可以殺傷腦膠質瘤細胞，在小鼠體內可以清除腦膠質瘤細胞，這為治療腦膠質瘤提供了一種新方法。LOUIS等[8]采用針對GD2的CAR-T治療19例神經母細胞瘤患者，8例患者臨床癥狀得以緩解，3例患者臨床癥狀幾乎得到了完全緩解。AHMED等[9]以人表皮生長因子受體(human epidermal growth factor receptor,Her)2為靶點治療19例Her2陽性肉瘤患者，3例患者腫瘤完全消失，4例患者臨床癥狀得到緩解，患者的平均中位生存期達到了10.3個月；BROWN等[10]利用靶向白細胞介素(interleukin,IL)-13受體α的CAR-T首次在患者體內清除了神經膠質母細胞瘤。此外，還有通過靶向間皮素治療胰腺癌[11-12]，通過靶向CD70治療頭頸部鱗癌和膠質瘤[13-14]，通過靶向表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)治療非小細胞肺癌和膠質母細胞瘤[15-16]，通過靶向磷脂酰肌醇蛋白聚糖3治療肝細胞癌[17]等。盡管CAR-T治療實體腫瘤的效果不如治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤的效果一樣理想，但目前的研究已經看到了CAR-T治療實體腫瘤的前景。

EGFR家族成員是許多實體腫瘤比較明確的靶標。EGFR是一種廣泛存在于人體表皮細胞和基質細胞的具有酪氨酸激酶活性的膜表面受體，其家族主要包括Her1(EGFR)、Her2、Her3和Her4 4個成員。目前，Her3已作為新的腫瘤治療靶點受到越來越多學者的重視[18-19]。Her3在乳腺癌、非小細胞肺癌、結直腸癌、頭頸癌、卵巢癌、胃癌和膀胱癌等多種惡性實體腫瘤中的表達均上調，通過配體依賴和非依賴途徑參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[20-21]。Her3被認為是一個促進腫瘤發(fā)生的細胞因子[22]，其本身無酪氨酸激酶活性，而Her2無配體結合，二者需要與其他受體結合形成異二聚體才能發(fā)揮作用，其中Her3/Her2異二聚體是Her家族信號傳導能力最強的二聚體，可以激活腫瘤細胞的絲裂原活化蛋白激酶信號通路和磷脂酰肌醇-3-激酶/絲蘇氨酸蛋白激酶通路促進細胞增殖，使細胞生長失控和惡性化[23]。同時，使用靶向Her2藥物進行治療時，多種腫瘤細胞的Her3表達上調，研究發(fā)現(xiàn)，當腫瘤細胞對靶向Her2的藥物產生耐受時，針對靶向Her3的治療可以克服藥物耐受性[24]。ZUO等[25]前期構建了靶向Her3的CAR-T，該CAR-T可識別殺傷Her3陽性表達的乳腺癌細胞SK-BR-3和BT-474，不能殺傷Her3表達下調和Her3陰性靶細胞；該CAR-T在裸鼠體內可以遏制SK-BR-3移植腫瘤的生長，有效延長荷瘤裸鼠的生存期，該研究為Her3陽性腫瘤治療提供了新思路和新方法。

3 實體腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment，TME)

TME中存在大量的免疫細胞及免疫抑制分子、內皮細胞、成纖維細胞及細胞外基質，它們與腫瘤細胞共同組成巨大的免疫抑制網絡[26]。TME中的抑制性免疫細胞如調節(jié)性 T 細胞、髓源性抑制細胞(myeloid derived suppressor cells，MDSC)和腫瘤相關巨噬細胞(tumor-associated macrophages，TAM)等分泌抑制性因子如IL-4、IL-10、IL-33、轉化生長因子β(transforming growth factor β，TGF-β)等[27]，這些細胞及其分泌的細胞因子使TME中的免疫系統(tǒng)處于耐受狀態(tài)，嚴重抑制CAR-T的抗腫瘤作用。另外，實體腫瘤細胞高表達程序性細胞死亡受體配體1(programmed death-ligand 1，PD-L1)，通過程序性細胞死亡受體-1(programmed cell death 1,PD-1)/PD-L1信號通路抑制T細胞的活性，產生免疫逃逸。T細胞發(fā)生免疫反應時分泌γ干擾素(interferon gamma，IFN-γ)，而IFN-γ可誘導腫瘤細胞PD-L1的表達[28]。因此，CAR-T在發(fā)揮抗腫瘤功能時不可避免地會受到PD-1/PD-L1信號通路的抑制。

CAR-T治療實體腫瘤時，如何克服免疫抑制性TME的干擾是面臨和必須解決的問題。研究者們進行了多種嘗試，如：通過共表達顯性失活的TGF-β受體，克服TGF-β信號通路對免疫反應的抑制作用[29]；通過共表達共刺激分子配體CD40L和4-1BBL，減緩CAR-T耗竭從而應對免疫抑制性TME[30]；聯(lián)合誘導性表達IL-12，通過激活固有免疫細胞增強CAR-T殺傷功能[31]；靶向自然殺傷細胞活化性受體NKG2D以識別免疫抑制性細胞表達的NKG2D配體，降低TME內MDSC及調節(jié)性T細胞的比例[32]；通過粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)中和反應減少MDSC募集，拮抗腫瘤免疫抑制進而增強CAR-T抗腫瘤活性[33]；通過設計PD-1-CD28嵌合受體[34]或將IL-4胞內區(qū)更換為IL-7胞內區(qū)[35]，使腫瘤細胞產生的抑制性信號轉換為激活性信號。此外，聯(lián)合使用單克隆抗體阻斷免疫檢查點分子PD-1或細胞毒T淋巴細胞相關抗原4的抑制作用，能進一步增強CAR-T的抗腫瘤功效[36]。

4 細胞因子釋放綜合征(cytokine release syndrome，CRS)

CAR-T在殺傷腫瘤細胞的同時釋放細胞因子以增強抗腫瘤作用，存在誘發(fā)細胞因子風暴的可能，即細胞因子釋放綜合征(cytokine release syndrome，CRS)。在應用CAR-T療法時，機體會釋放IL-1、IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、GM-CSF、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)、IFN-γ等多種細胞因子，誘發(fā)患者出現(xiàn)高熱、低血壓、頭痛，嚴重者出現(xiàn)呼吸困難、呼吸衰竭、多器官功能衰竭等癥狀，甚至死亡[37]。關于CRS產生的機制尚不十分清楚，目前普遍認為，CAR-T識別腫瘤細胞后會激活旁觀者免疫細胞和非免疫細胞(如內皮細胞)[38]，導致CRS。旁觀者免疫細胞被激活后釋放大量細胞因子，其中IL-6、IL-10和IFN-γ是核心細胞因子，IFN-γ 可以導致患者出現(xiàn)發(fā)熱、寒戰(zhàn)、頭痛、頭暈和疲勞。IFN-γ也可以激活其他免疫細胞，其中最重要的是巨噬細胞，活化的巨噬細胞產生大量細胞因子，如IL-6、TNF-α和IL-10等。TNF-α可以導致患者出現(xiàn)類似感冒樣癥狀。IL-6在CRS的發(fā)生、發(fā)展過程中起關鍵作用，在CRS患者和小鼠模型中均可觀察到IL-6水平持續(xù)升高，高水平的IL-6可以導致患者出現(xiàn)毛細血管滲漏、補體被激活和彌散性血管內凝血[39]。非免疫細胞中的內皮細胞活化后可引起血清血管生成素-2和血管性血友病因子水平升高[40]，這2種細胞因子可引起患者出現(xiàn)毛細血管滲漏、低血壓和凝血功能障礙等，嚴重者可以導致患者死亡。同時，內皮細胞活化也可以產生IL-6。剖檢1例因CAR-T治療死亡患者時發(fā)現(xiàn)，內皮細胞分泌的高水平IL-6可能是引起嚴重CRS的主要原因，CRS導致了患者的死亡[41]。根據(jù)目前的研究報道，在使用CAR-T治療惡性腫瘤的過程中，患者出現(xiàn)CRS暫時無法避免，但可以采用IL-6受體阻斷劑托珠單抗和糖皮質激素類藥物進行干預，嚴重時可采用血液透析治療[38]。CAR-T治療實體腫瘤還可能出現(xiàn)其他不良反應，如神經毒性和溶瘤綜合征等。因此，如何在CAR-T設計過程中提高CAR-T的安全性，最大限度地減弱患者出現(xiàn)細胞因子風暴的強度，將是今后的主要研究方向之一。

5 CAR-T細胞來源

目前，針對實體腫瘤的治療方法主要有手術治療、化學治療、放射治療和靶向治療4種方式，CAR-T 療法屬于靶向治療的一種。近年來，化學治療、放射治療聯(lián)合CAR-T已成為腫瘤治療的新策略。制備CAR-T最理想的細胞來源是使用患者自身T細胞，但利用患者自體T細胞制備CAR-T的方法尚存在不足。由于患者經過化學治療或放射治療后，從其體內分離的T細胞往往數(shù)量不足或功能障礙，患者自體T細胞的分篩及基因編輯CAR-T周期長，極為費時費力，這些均直接影響CAR-T的治療效果。在全球CAR-T行業(yè)的巨頭公司，研究人員使用健康人T細胞制備CAR-T解決了這一問題。2016年輝瑞公司宣布與Cellectis公司合作進軍CAR-T領域，Cellectis公司主要提供健康人的T細胞。2016年2月，Baxalta公司與Precision Bioscience公司合作開發(fā)基于健康供者T細胞的新型通用型CAR-T用于腫瘤治療。2017年3月，國際著名免疫學家ALDERTON教授在《Nature Reviews Cancer》發(fā)表評論，指出應用健康人T細胞制備通用型CAR-T將會是CAR-T未來發(fā)展的方向之一[42]。由于健康供者T細胞對于患者而言是同種異體細胞，如何消除患者對外源同種異體細胞的免疫排斥反應是需要解決的關鍵問題。2017年，QASIM等[43]用轉錄激活因子樣效應物核酸酶技術將人類白細胞抗原 (human leukocyte antigen，HLA)不相符合的健康者T細胞的CD52分子和T細胞抗原受體 (T cell receptor，TCR)基因敲除，進而改造成靶向CD19分子的通用型CAR-T，對2例急性B淋巴細胞白血病嬰兒進行治療，2例患兒雖未治愈，但癥狀得到明顯緩解。REN等[44]通過CRISPR/Cas9同時敲除TCR和HLA I類分子構建了通用型CAR-T，其可以減緩宿主針對異體細胞發(fā)生的免疫排斥反應，同時宿主未發(fā)生移植物抗宿主病。上述研究展示了通用型CAR-T對腫瘤的治療效果，這為今后設計其他通用型CAR-T提供了參考依據(jù)。

6 展望

近年來，CAR-T治療實體腫瘤的臨床試驗項目顯著增加，幾乎呈指數(shù)增長。30 a時間內，CAR-T免疫療法從概念到可以具體操作的方案，尤其是CAR-T免疫療法在血液系統(tǒng)惡性腫瘤治療中取得的驚人突破，讓人們看到了徹底攻克某些類型腫瘤的希望。雖然，CAR-T在實體腫瘤治療領域的研究進展相對緩慢，治療效果不如血液系統(tǒng)惡性腫瘤理想，但是，相信CAR-T治療實體腫瘤與其他技術一樣，還需要經歷一個長的發(fā)展期才能進入到逐漸成熟的階段，CAR-T聯(lián)合其他療法治療實體腫瘤將會是未來的發(fā)展趨勢。CAR-T治療實體腫瘤盡管有困難，但未來仍值得期待。隨著相應研究成果的出現(xiàn)，CAR-T治療實體腫瘤也將迎來新曙光。