馮佳 龔書識(shí) 夏燕 田瑞 楊年安 趙小丹 蔡德慧 向陽(yáng) 袁林*

1. 湖北民族學(xué)院風(fēng)濕性疾病發(fā)生與干預(yù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 恩施 445000 2. 湖北民族學(xué)院附屬民大醫(yī)院，湖北 恩施 445000

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以滑膜炎、軟骨和骨破壞為特征的慢性炎癥性自身免疫性疾病[1]。RA發(fā)病后半年內(nèi)即可發(fā)生不可逆的關(guān)節(jié)滑膜損傷，并出現(xiàn)炎性關(guān)節(jié)附近的骨量丟失，兩年內(nèi)即可出現(xiàn)軟骨下骨質(zhì)的破壞及全身范圍的骨量流失，逐漸發(fā)展為關(guān)節(jié)活動(dòng)受限[2]。研究發(fā)現(xiàn)，在RA患者和CIA關(guān)節(jié)炎大鼠骨質(zhì)破壞處發(fā)現(xiàn)大量活化的破骨細(xì)胞和成熟破骨細(xì)胞[3]，提示破骨細(xì)胞的分化和成熟可能是導(dǎo)致RA骨破壞的重要環(huán)節(jié)。艾拉莫德(Iguratimod)是一種新型小分子緩解病情抗風(fēng)濕藥物[4]，研究認(rèn)為其通過(guò)抑制細(xì)胞免疫及體液免疫，達(dá)到治療RA的療效，在臨床得到廣泛使用。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)艾拉莫德還可以改善RA患者的骨代謝狀況：Shin D[5]等運(yùn)用動(dòng)物模型、Gan K[6]等以RAW264.7細(xì)胞模型進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)艾拉莫德通過(guò)抑制核因子-κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)的激活促進(jìn)骨形成和抑制骨破壞。本研究通過(guò)觀察不同濃度艾拉莫德對(duì)RA患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)所誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的分化與骨吸收的影響，探討破骨細(xì)胞在RA骨質(zhì)破壞中的作用及艾拉莫德防治RA可能的分子機(jī)制，為RA的治療提供新途徑、新思路。

1 材料與方法

1.1 病例資料

選取2017年3月至2017年10月在湖北民族學(xué)院附屬民大醫(yī)院風(fēng)濕科住院治療的RA患者20例,女性17例,男性3例,年齡46±14歲。診斷均符合2010年歐洲抗風(fēng)濕聯(lián)盟/美國(guó)風(fēng)濕病協(xié)會(huì)(EULAR/ACR)分類標(biāo)準(zhǔn)。且患者均未接受過(guò)艾拉莫德治療，均無(wú)合并嚴(yán)重心、肝、腎疾病、惡性腫瘤、糖尿病等疾病。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均簽署書面知情同意書。

1.2 藥物與試劑

艾拉莫德(先聲藥業(yè)公司)每片25 mg，溶解在1 mL的DMSO中，使用時(shí)用1640培養(yǎng)基稀釋。RANKL及M-CSF均購(gòu)自美國(guó)Pepro Tech公司，用含10%FBS的1640培養(yǎng)基配成濃度為100 ng/mL RANKL和50 ng/mL M-CSF的誘導(dǎo)培養(yǎng)液。Ficoll-paque PLUS及TRAP染色試劑盒購(gòu)自GE公司，RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司，Cell Counting Kit-8(CCK-8)購(gòu)自東仁化學(xué)科技有限公司，TRIzol Reagent購(gòu)自Ambion公司，Prime Script RT reagent kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)及 SYBR Premix Ex Taq(Tli RNase H Plus)購(gòu)自TaKaRa公司，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

OD-1000+超微量分光光度計(jì)、LC480實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自Roche公司，BX50熒光顯微鏡購(gòu)自O(shè)lympus公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)的分離及破骨細(xì)胞的誘導(dǎo)

采患者空腹靜脈血5 mL入肝素抗凝管中，采用Ficoll密度梯度離心方法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，用含10%FBS的1640培養(yǎng)液將細(xì)胞濃度調(diào)整為2×106/mL。將收集的PBMCs細(xì)胞懸液接種于24孔培養(yǎng)板中，每孔加入0.5 mL懸液。在細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，輕輕吸除培養(yǎng)孔中培養(yǎng)液，沿孔壁緩慢加入0.5 mL誘導(dǎo)培養(yǎng)液，隔兩天換1次誘導(dǎo)培養(yǎng)液，連續(xù)培養(yǎng)14天。

1.4.2破骨細(xì)胞的鑒定

顯微鏡下觀察貼壁細(xì)胞的生長(zhǎng)形態(tài)、細(xì)胞分化融合形成多核細(xì)胞的情況。按照TRAP 染色試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行染色。顯微鏡下觀察含有3個(gè)及以上細(xì)胞核且TRAP染色陽(yáng)性的多核巨細(xì)胞為破骨細(xì)胞。200倍光鏡下隨機(jī)選l0個(gè)視野，計(jì)數(shù)破骨細(xì)胞數(shù)量，結(jié)果用個(gè)/10個(gè)視野表示，每孔重復(fù)計(jì)數(shù)3次，取其均數(shù)。

1.4.3CCK-8 檢測(cè)艾拉莫德對(duì)PBMC的毒性作用

將分離的RA患者PBMCs 用培養(yǎng)液配制成5×105/mL的細(xì)胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板中，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。待細(xì)胞貼壁后，去除培養(yǎng)基，分別加入含不同濃度艾拉莫德的培養(yǎng)基各100 μL，在培養(yǎng)24、48、72 h后，向每孔中加入10 μL CCK-8溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1.5 h。用酶標(biāo)儀測(cè)定各組在450 nm波長(zhǎng)處的吸光度OD值，計(jì)算細(xì)胞活力。

1.4.4艾拉莫德對(duì)RA患者PBMC生成破骨細(xì)胞的影響

將收集的RA患者PBMCs配制成2×106/mL細(xì)胞懸液，接種于24孔培養(yǎng)板中，每孔加入0.5 mL，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。分為4組：對(duì)照組、艾拉莫德25μg/mL實(shí)驗(yàn)組、艾拉莫德12.5μg/mL實(shí)驗(yàn)組、艾拉莫德6.25μg/mL實(shí)驗(yàn)組，艾拉莫德各實(shí)驗(yàn)組加入含不同濃度艾拉莫德的誘導(dǎo)培養(yǎng)液培養(yǎng)，對(duì)照組為不含艾拉莫德的誘導(dǎo)培養(yǎng)液，隔兩天換1次誘導(dǎo)培養(yǎng)液，連續(xù)培養(yǎng)14天。TRAP染色。

1.4.5艾拉莫德對(duì)RA患者外周血破骨細(xì)胞TRAP、CTSK、RANK、AP-1 mRNA表達(dá)的影響

收集各組細(xì)胞，按照TRIzol Reagent說(shuō)明書提取RNA，測(cè)定RNA純度及濃度，A260/A280比值為1.8～2.0。合成cDNA: 5×gDNA Eraser Buffer 2 μL、gDNAEraser 1 μL、總RNA 1μg，42 ℃ 2 min; 5 × Prime Script Buffer 4 μL、Prime Script RT Enzyme Mix I 1 μL、RT Primer Mix 1 μL、無(wú)RNA酶dH2O 4 μL，37 ℃ 15 min，85 ℃ 5s; cDNA儲(chǔ)存于-20 ℃。實(shí)時(shí)熒光定量RCP檢測(cè)TRAP、CTSK、RANK、AP-1 mRNA的表達(dá)，GAPDH為內(nèi)參基因。反應(yīng)體系10 μL:SYBR Premix Ex Taq 5 μL、上游引物0.3 μL、下游引物0.3 μL、模板1 μL、dH2O 3.4 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 預(yù)變性30 s、95 ℃變性5 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)?；虮磉_(dá)量以2-△△CT表示實(shí)驗(yàn)組目的基因表達(dá)相對(duì)于對(duì)照組變化的倍數(shù)。

1.4.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 破骨細(xì)胞誘導(dǎo)形態(tài)學(xué)觀察

PBMCS培養(yǎng)24 h后，部分細(xì)胞貼壁,為單核細(xì)胞(見圖1 A)；誘導(dǎo)培養(yǎng)第3天，出現(xiàn)少數(shù)單個(gè)核成纖維樣細(xì)胞生長(zhǎng)(見圖1B)；培養(yǎng)第8天，成纖維樣細(xì)胞明顯增多，可見少數(shù)多核細(xì)胞，圓形或不規(guī)則形(見圖1C)；培養(yǎng)第14天出現(xiàn)較多多核細(xì)胞，胞體較其他細(xì)胞大，折光性強(qiáng)，形似油煎蛋形樣或長(zhǎng)條狀(見圖1D)。

圖1 顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)觀察(200×)A: 24小時(shí) B: 第 3 天 C: 第 8 天D: 第14天Fig.1 Observation of the cell morphology (200×)A: 24 h; B: the 3nd day; C: the 8th day; D: the 14th day

2.2 破骨細(xì)胞鑒定結(jié)果

將誘導(dǎo)培養(yǎng)14天的細(xì)胞進(jìn)行TRAP染色，顯微鏡下可見大量多核細(xì)胞, 胞核3～20個(gè)不等,胞質(zhì)內(nèi)有紫紅色顆粒樣沉淀,即為破骨細(xì)胞。(見圖2)

圖2 破骨細(xì)胞 TRAP 染色(A: 100倍 B: 200倍)Fig.2 TRAP staining of the osteoclasts (A: 100×; B: 200×)

圖4 不同濃度艾拉莫德對(duì)RA患者破骨細(xì)胞的影響A.對(duì)照組;B.艾拉莫德25μg/mL組;C.艾拉莫德12.5μg/mL組;D.艾拉莫德6.25μg/mL組Fig.4 Effects of different concentrations of Iguratimod on osteoclasts in RA patientsA. Control Group; B. Iguratimod 25μg/mL Group; C. Iguratimod 12.5μg/mL Group; D. Iguratimod 6.25μg/mLGroup

2.3 艾拉莫德對(duì)PBMCs的毒性作用

CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示艾拉莫德25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL三個(gè)濃度對(duì)PBMCs細(xì)胞活力無(wú)明顯影響(圖3所示)。

2.4 艾拉莫德對(duì)RA患者PBMCs生成破骨細(xì)胞的影響

不同濃度艾拉莫德干預(yù)RA患者PBMCs生成破骨細(xì)胞，結(jié)果顯示艾拉莫德6.25 μg/mL組、12.5 μg/mL組、25 μg/mL組的破骨細(xì)胞數(shù)量均明顯低于對(duì)照組(P<0.05)。(圖4，圖5所示)

圖3 艾拉莫德對(duì)PBMCs細(xì)胞活力的影響Fig.3 The effect of Iguratimod on the activity of PBMCs

圖5 艾拉莫德對(duì)RA患者破骨細(xì)胞數(shù)量的影響注：* P<0.05Fig.5 The effect of Iguratimod on the number of osteoclasts in RA patients. Note:* P<0.05

2.5 艾拉莫德對(duì)RA患者外周血破骨細(xì)胞TRAP、CTSK、RANK、AP-1 mRNA表達(dá)的影響

艾拉莫德6.25 μg/mL組、12.5 μg/mL組、25 μg/mL組破骨細(xì)胞TRAP mRNA表達(dá)分別為對(duì)照組的0.4271、0.1468、0.1306倍；CTSK mRNA表達(dá)分別為對(duì)照組的0.812、0.106、0.0957倍；RANK mRNA表達(dá)分別為對(duì)照組的0.891、0.538、0.411倍；AP-1 mRNA表達(dá)分別為對(duì)照組的0.736、0.1083、0.0957倍。說(shuō)明艾拉莫德能抑制TRAP、CTSK、RANK、AP-1 mRNA的表達(dá)水平，且隨艾拉莫德濃度的升高抑制作用越明顯，與對(duì)照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。(圖6所示)

圖6 艾拉莫德對(duì)RA患者外周血破骨細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)的影響A.TRAP mRNA B.CTSK mRNA C.RANK mRNA D.AP-1 mRNA注：*P<0.05Fig.6 Effect of Iguratimod on the expression of osteoclast-related genes in RA patientsA. TRAP mRNA; B. CTSK mRNA; C. RANK mRNA; D. AP-1 mRNANote:*P<0.05

3 討論

骨侵蝕是RA的主要特征,而破骨細(xì)胞是骨侵蝕發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[7]。破骨細(xì)胞是一種終末分化的多核巨噬細(xì)胞，來(lái)源于單核/巨噬細(xì)胞系統(tǒng)[8]。單核巨噬破骨細(xì)胞前體細(xì)胞和部分外周血單核細(xì)胞在骨組織中被激活，聚集并粘附于骨表面, 各種細(xì)胞因子和自身抗體刺激破骨細(xì)胞的活化，并通過(guò)分泌酸和溶解酶來(lái)降解骨基質(zhì), 從而促進(jìn)骨吸收[9]。RANKL和M-CSF是破骨細(xì)胞形成的主要細(xì)胞因子,RANKL調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的分化和激活,促進(jìn)破骨細(xì)胞遷移;M-CSF與受體c-fsm結(jié)合,促進(jìn)破骨前體細(xì)胞的再生[10]。TRAP是破骨細(xì)胞特有的一種酶，破骨細(xì)胞溶酶體膜有較高的TRAP作用，在含酒石酸的酸性條件下，將產(chǎn)生的萘酚磷酸鹽水解物與染色劑結(jié)合，在酶的活性部位形成不溶的紅色沉淀，TRAP染色陽(yáng)性為破骨細(xì)胞的典型標(biāo)志[11]。研究發(fā)現(xiàn)[12]RA患者外周血生成破骨細(xì)胞的數(shù)量顯著高于健康對(duì)照組，RA患者的骨吸收活性也明顯高于對(duì)照組，認(rèn)為外周血破骨細(xì)胞可能是反映RA患者關(guān)節(jié)骨質(zhì)破壞的重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)使用100 ng/mL RANKL和50 ng/mL M-CSF誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的形成, 在第8天出現(xiàn)少數(shù)多核細(xì)胞,第14天出現(xiàn)較多多核細(xì)胞,TRAP染色陽(yáng)性,成功將RA患者PBMCs誘導(dǎo)為破骨細(xì)胞。

艾拉莫德是由國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局臨床批準(zhǔn)的Ⅰ類新藥，用于治療成人活動(dòng)性RA[13]。多項(xiàng)基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，艾拉莫德通過(guò)抑制與RA病情活動(dòng)密切相關(guān)的促炎因子，起到控制RA及RA引起骨流失的雙重效果，艾拉莫德還能顯著抑制CIA大鼠模型骨吸收和關(guān)節(jié)破壞，證實(shí)艾拉莫德具有減輕RA骨破壞的作用[14]。本實(shí)驗(yàn)使用不同濃度艾拉莫德作用于PBMCs,發(fā)現(xiàn)艾拉莫德25 μg/mL、12.5 μg/mL、6.25 μg/mL三個(gè)濃度對(duì)PBMCs細(xì)胞無(wú)明顯細(xì)胞毒性作用,在此基礎(chǔ)上,使用上述三個(gè)濃度艾拉莫德干預(yù)RA患者PBMCs生成破骨細(xì)胞，結(jié)果顯示艾拉莫德實(shí)驗(yàn)組均能抑制破骨細(xì)胞的生成,其中艾拉莫德25 μg/mL組抑制作用最為顯著。

Rank是腫瘤壞死因子受體超家族成員之一,表達(dá)于破骨細(xì)胞及前體細(xì)胞膜表面,與成骨細(xì)胞產(chǎn)生的RANKL結(jié)合，啟動(dòng)下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，刺激破骨細(xì)胞前體細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞，促進(jìn)骨吸收。轉(zhuǎn)錄因子AP-1是破骨細(xì)胞分化的主要調(diào)節(jié)因子[15],調(diào)整破骨細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá),如TRAP, CTSK等,在破骨細(xì)胞活化中起重要作用[16]。研究表明RA患者破骨細(xì)胞活性增加對(duì)全身性骨量丟失發(fā)揮著重要作用[17]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察不同濃度艾拉莫德對(duì)RA患者外周血破骨細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)的影響,發(fā)現(xiàn)艾拉莫德能抑制TRAP、CTSK、RANK、AP-1 mRNA的表達(dá)水平，且隨艾拉莫德濃度的升高抑制作用越明顯,與顯微鏡下觀察結(jié)果一致。

綜上,艾拉莫德具有體外抑制RA患者PBMCs向破骨細(xì)胞分化的作用，能夠抑制RA患者外周血破骨細(xì)胞TRAP、CTSK、RANK、AP-1 mRNA的表達(dá)，且均呈濃度依賴性。RA骨平衡的紊亂主要是由破骨細(xì)胞所驅(qū)動(dòng), 艾拉莫德通過(guò)抑制破骨細(xì)胞，阻止RA骨質(zhì)破壞，成為RA臨床治療的新選擇。