王信 張怡 陳萍 季文軍 馬亞萍 敖俊,* 張軍,*

1. 遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院骨科，貴州 遵義 563000 2. 遵義醫(yī)學院公共衛(wèi)生學院，貴州 遵義 563000 3. 遵義醫(yī)學院-羅切斯特大學骨科研究中心，貴州 遵義 563000

白介素-6(Interleukin-6，IL-6)作為一種多功能細胞因子，在人體內含量甚微，對骨代謝的調節(jié)具有雙重作用：既可以通過結合IL-6特異性受體，激活Ras/Raf/MEK/ERK、JAK/STAT3、PI3K等信號通路發(fā)揮破骨效應；又可以促進成骨細胞中堿性磷酸酶、骨鈣素等表達，從而加強骨基質的礦化形成[1]。在我們前期實驗中，已經證實了100 ng/mL骨保護素(Osteoprotegerin，OPG)和IL-6聯(lián)合抑制小鼠單核-巨噬細胞的成熟和分化[2]。本次實驗旨在研究不同濃度的IL-6因子直接對破骨細胞分化和破骨功能的影響是否存在濃度依賴性，從而為今后防治骨質疏松癥提供一定的實驗基礎。

1 方法和材料

1.1 主要試劑

實驗選用小鼠單核/巨噬細胞系RAW264.7細胞由重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院骨科惠贈；小鼠重組sRANKL購于美國PeproTech公司，用無菌PBS溶液將其配制為工作濃度為50 ng/mL的溶液；IL-6試劑購于PeproTech公司，使用時用無菌PBS溶液將其稀釋成工作濃度為50 ng/mL、100 ng/mL、150 ng/mL的液體。胎牛血清購于美國GIBCO公司；DEME高糖培養(yǎng)基購于美國GIBCO公司；TRAP染色試劑盒購于美國Simga公司。

1.2 實驗方法

1.2.1RAW264.7細胞培養(yǎng)

將RAW264.7細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清(FBS)的高糖DMEM培養(yǎng)基，溫度控制于37 ℃，含有5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，常規(guī)換液。取出細胞種植入無菌六孔板中，單用50 ng/mL RANKL干預RAW264.7細胞1 d后，分為4組，1空白對照組(1 mL 50 ng/mL RANKL + PBS 1 mL)、2低濃度IL-6組(1 mL 50 ng/mL RANKL + 1 mL 50 ng/mL IL-6)、3中濃度IL-6組(1 mL 50 ng/mL RANKL + 1 mL 100 ng/mL IL-6)、4高濃度IL-6組(1 mL 50 ng/mL RANKL + 1 mL 150 ng/mL IL-6)。分別向各組中加入1 mL DMEM培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)至第9天，進行如下實驗：

1.2.2HE染色

蓋玻片經濃硫酸過夜浸泡、沖洗并消毒處理后，放置于6孔板中，待上述細胞完成80%以上的細胞爬片后，進行HE組織染色，，每組選用3個蓋玻片進行觀察成熟破骨細胞的染色情況，每個蓋玻片采集5個不同的視野。采用光鏡下測量成熟破骨細胞生成數(shù)，主要是根據(jù)破骨細胞核的多核細胞(超過3個細胞核)形成數(shù)量來判定成熟破骨細胞生成量。

1.2.3TRAP特異性染色

細胞如同上述方法處理，參照試劑盒說明書進行TRAP染色，經過TRAP染色后，成熟破骨細胞胞漿被染成典型的玫瑰紅，細胞核則會被蘇木精染成深藍或藍紫色。通過倒置顯微鏡下采集圖像后，經圖像分析軟件測量玫瑰紅色細胞漿在每個高倍鏡視野下所占的累計面積，每組分別采集3個標本，每個標本采集5個不同的視野，求得平均值，計算其占視野面積的百分比。

1.2.4骨片掃描電鏡檢查

取新鮮小鼠顱骨，制成面積為1 cm×1 cm，厚度約65 μm左右的薄骨片，清洗4-5次/20 min，用以去除多余的軟組織。然后，將其置于4 ℃冰箱保存。使用前取出浸泡在75%酒精過夜后，并暴露在紫外線照射8 h以上。以1×107個/孔接種RAW264.7細胞于每個薄骨片上，予以50 ng/mL RANKL干預1 d后，如上述方法繼續(xù)用不同濃度的IL-6刺激和培養(yǎng)9 d，無菌PBS沖洗，戊二醛和鋨酸雙固定后、酒精梯度脫水，CO2真空干燥，鍍金，掃描電鏡觀察骨吸收陷窩形成情況。采用圖像分析軟件對上述各組骨吸收陷窩面積進行計算，統(tǒng)計各組3個標本，每個標本5個不同視野進行陷窩面積的計算，求得平均值，計算其占視野面積的百分比。

1.2.5統(tǒng)計學分析

圖像采集Leica(FX-BUSRS232C)顯微鏡、Nikon倒置熒光顯微鏡，圖像分析利用Image Pro-Plus 6.0軟件，統(tǒng)計應用SPSS 10.0版軟件，組間比較應用方差分析的方法，P值<0.05判斷為差異有顯著性。數(shù)據(jù)表達均使用均數(shù)±標準誤差形式。

2 結 果

2.1 HE染色結果

空白對照組中的破骨細胞，在RANKL的刺激下細胞胞體明顯增大，胞質豐富，可見細胞間融合現(xiàn)象，有典型多核形成表現(xiàn)。低濃度IL-6組中仍可見少許成熟破骨細胞形成，并隨著濃度的增高，多核形成不明顯(如圖1)。經過光鏡計數(shù)，成熟破骨細胞生成數(shù)量結果如下：空白對照組152.50±35.24；IL-6組中分別為 120.8±18.89、66.5±17.23、35.25±19.0。中和高濃度IL-6組明顯少于對照組(P<0.05)。

圖1 HE染色下各組破骨細胞的形態(tài)學變化A：空白對照組 B：50 ng/mL IL-6組 C：100 ng/mL IL-6組 D：150 ng/mL IL-6組Fig.1 The morphological changes of osteoclast cells in HE staining (×200)A: Control group; B: 50 ng/mL IL-6 group; C: 100 ng/mL IL-6 group; D: 150 ng/mL IL-6 group

2.2 TRAP染色結果

50ng/mL RANKL處理的空白對照組，胞質染色明顯較深，陽性染色面積區(qū)域大；低和中濃度IL-6組偶見陽性染色區(qū)域，且面積較小和少，僅可見少許粉紅色區(qū)域；高濃度IL-6組中，染色更淺，比較難找到陽性染色區(qū)域(如圖2)。通過倒置相差顯微鏡采集圖像，經圖像分析軟件測量其區(qū)域面積，空白對照組、低濃度IL-6組、中濃度IL-6組和高濃度IL-6組TRAP染色陽性區(qū)域與視野面積百分比分別為(12.63±1.28)%、(10.98±0.99)%、(4.69±0.79)%、(2.26±0.83)%，可見，IL-6濃度超過50ng/mL后，中、高處理組和空白對照組的染色面積差異顯著(P<0.05)。

圖2 TRAP染色下各組破骨細胞的成熟分化情況A：空白對照組 B：50 ng/mL IL-6組 C：100 ng/mL IL-6組 D：150 ng/mL IL-6組Fig.2 Assessment of osteoclastic differentiation and maturation with TRAP staining (×200)A: Control group; B: 50ng/mL IL-6 group; C: 100ng/mL IL-6 group; D: 150ng/mL IL-6 group

2.3 骨片掃描電鏡觀察

掃描電鏡觀察，明顯可見骨陷窩形態(tài)及大小均不一，狀如圓形、橢圓形或不規(guī)則形?？瞻讓φ战M中骨片上可見散在、分布不均的因破骨細胞的骨吸收作用引起的骨陷窩，鈣質丟失較多，有的形成空洞征象；低濃度IL-6組中骨質破壞明顯減輕，仍可見破骨細胞的偽足和少許空洞形成；中濃度IL-6組中，破骨細胞偽足形成不明顯，未見明顯空洞形成，但可見微小的凹陷形成；高濃度的IL-6組中骨質較完整，未見明顯的骨陷窩形成和骨質破壞(如圖3)。掃描電鏡下采集圖像，經圖像分析軟件計算和分析陷窩面積，空白對照組、IL-6組和聯(lián)合組的骨吸收區(qū)域與視野面積的百分比分別為：(11.24±1.50)%，(9.41±1.71)%、(3.65±1.04)%、(2.39±0.71)%。由此可見，中、高IL-6處理組和空白對照組間存在明顯差異(P<0.05)，而低濃度IL-6組和中高濃度IL-6組之間的吸收面積之間也存在顯著性差異(P<0.05)。

圖3 掃描電鏡下各組骨陷窩形成情況A：空白對照組 B：50 ng/mL IL-6組 C：100 ng/mL IL-6組 D：150 ng/mL IL-6組Fig.3 Evaluation of bone graft resorption using SEM (×800)A: Control group; B: 50 ng/mL IL-6 group; C: 100 ng/mL IL-6 group; D: 150 ng/mL IL-6 group

3 討 論

成骨細胞所介導的骨形成和破骨細胞所介導的骨吸收緊密相聯(lián)，而這動態(tài)平衡一旦失衡往往導致骨代謝性疾病的發(fā)生，如OP[3]。破骨細胞是由單核/巨噬細胞的前體細胞(又稱為破骨前體細胞，Osteoclast precursors，OCP)分化而來，其正常成熟分化的條件必須具備c-Fms和RANK兩種受體[4]。然而，由OCP轉化為成熟破骨細胞的過程是一個復雜的多細胞間通過信號通路交互對話的過程[5]。一直以來，由基質/成骨細胞釋放的RANKL因子被公認為調節(jié)OC分化、激活、成熟、凋亡等一系列過程最重要的因子之一[6]。本實驗使用的破骨樣細胞RAW264.7細胞，是一種經典的破骨前體細胞模型[7-8]。

在正常生理情況下，骨基質細胞和成骨細胞除了分泌RANKL，還能分泌OPG來和RANKL競爭結合位點，從而抑制骨質的過度吸收[9, 10]。實驗證明，OPG能有效地抑制破骨細胞的激活、分化，并誘導其發(fā)生凋亡[11-12]。所以，OPG/RANKL的比例多少在維持骨量平衡和調控骨重建過程，起著極為重要的作用。通過聯(lián)合運用OPG和IL-6，發(fā)現(xiàn)兩者存在一定的協(xié)同作用，較單獨運用OPG組更能有效地抑制RAW264.7細胞的成熟分化(P<0.05)[2]。

IL-6是由T細胞、B細胞、單核細胞、基質細胞/成骨細胞激活后分泌，它是一個分子家族的原型。該家族包括：ILF、OSM、CT-1、IL-11和CNTF等，它們都有一個極其相似的螺旋結構[13]。IL-6的生物學活性需要通過其受體介導，IL-6受體是由IL-6的特異受體結構鏈(IL-6R α)和IL-6的信號傳遞鏈(IL-6R β，亦稱gp130)組成[14]。IL-6只有先與IL-6R α相結合，并形成IL-6/ IL-6R α復合物后才能與gp130結合，進而激活Ras/Raf/ERK/MEK、JAK/STAT3等信號傳導通路而發(fā)揮生物效應[15]。Laurence等證明：單獨加入IL-6對破骨細胞的分化未見明顯影響，但IL-6可以在分化早期(小于3天)以劑量依賴方式明顯抑制外源性RANKL誘導的破骨細胞分化[16]。IL-6能刺激成骨細胞產生大量的下游信號分子，如IL-1、PGE2等等，抑制OPG的表達，促進RANKL的表達，進而間接促進破骨細胞形成并加強破骨活動[17]，IL-6又能通過抑制NF-κB信號通路的激活，從而直接抑制破骨細胞的成熟分化和骨吸收作用[18]，這與本研究結果相一致。

本實驗采用RAW264.7細胞作為破骨前體細胞，在體外給與不同濃度的IL-6因子進行干預，當濃度超過50 ng/mL時，連續(xù)作用至第10天時，可以觀察到明顯的抑制作用?？瞻讓φ战M和IL-6處理組進行比較，成熟破骨細胞的生成數(shù)量和骨陷窩形成的數(shù)量進行統(tǒng)計學分析后，均有顯著的統(tǒng)計學意義，且它們存在一定的劑量-效應依賴關系。然而，IL-6如何參與到抑制破骨細胞分化的分子機制，還需要在進一步實驗去研究IL-6和RANKL之間的相互作用關系。