劉菊 趙晟珣 陳輝

武漢市第一醫(yī)院老年病科，湖北 武漢 430022

流行病學(xué)調(diào)查顯示[1],我國(guó)骨質(zhì)疏松發(fā)病率是 16.1%，其中男性發(fā)病率為11.2%，女性為 19.9%,而且隨著我國(guó)社會(huì)老齡化進(jìn)程的不斷加速，發(fā)病率呈現(xiàn)出上升的趨勢(shì)，預(yù)計(jì)到 2020 年，我國(guó)骨質(zhì)疏松患者將高達(dá)2.866 億[2]。

老年原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥可以引起骨質(zhì)丟失，誘發(fā)骨折，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和預(yù)期壽命。在該病患者中，體內(nèi)活性氧水平明顯增高，提示氧化應(yīng)激在該病發(fā)生和發(fā)展中起重要作用[3]。乙醛脫氫酶 2(aldehyde dehydrogenase2, ALDH2)不僅是乙醇代謝過(guò)程中關(guān)鍵酶之一，而且是重要的抗氧化應(yīng)激分子。目前ALDH2 對(duì)骨質(zhì)疏松是否有影響的相關(guān)報(bào)道較少?？紤]女性患者受雌激素影響較大，本研究采用 DNA微陣列芯片法，對(duì)ALDH2 基因多態(tài)性與老年男性骨質(zhì)疏松的相關(guān)性進(jìn)行對(duì)比研究，以期探討 ALDH2基因單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)與骨質(zhì)疏松的關(guān)系，為臨床早期進(jìn)行干預(yù)性防治骨質(zhì)疏松提供可靠的理論依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

回顧性調(diào)查: 收集武漢第一醫(yī)院老年科 2016 年 1 月至 2017年 11 月住院的老年男性人群(年齡≥65歲) 作為研究對(duì)象，共計(jì) 204 例，符合下列入選標(biāo)準(zhǔn): 所有病例均排除嚴(yán)重腦血管病、急性心肌梗死、惡性腫瘤、嚴(yán)重肝腎功能不全、各種急性感染、影響骨代謝的疾病和服用影響骨代謝的藥物、手術(shù)或其他應(yīng)激情況。將 204 例實(shí)驗(yàn)對(duì)象隨機(jī)分為兩組: 第1組：符合 WHO 原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]，即雙能X線(xiàn)法檢測(cè)骨密度(Bone mineral density,BMD)T檢測(cè)值(T-score,)低于同性別、同種族健康成人的骨峰值2.5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差，除外繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥老年男性患者(平均年齡 76.69±5.22) 117 例，作為原發(fā)性骨質(zhì)疏松組 OP 組; 第2組：同期住院無(wú)骨質(zhì)疏松癥,即BMD正常的老年男性人群(平均年齡 77.42±6.44) 87例，作為非骨質(zhì)疏松癥組。

1.2 方法

1.2.1一般資料和生化指標(biāo)測(cè)定：收集入選病例的年齡、測(cè)量身高、體重、計(jì)算體重指數(shù)(Body Mass Index,BMI)：體重(kg) /身高(m)2，測(cè)量收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)，記錄吸煙、飲酒情況，體檢者空腹、脫鞋去帽、穿單衣，采用統(tǒng)一的測(cè)量工具測(cè)量。采集空腹 8 h 以上的肘靜脈血，用奧林巴斯AU400 全自動(dòng)生化儀檢測(cè)空腹血糖(Fasting blood-glucose，F(xiàn)BG)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、C 反 應(yīng) 蛋 白 (reactiveprotein,CRP)，運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附(enzyme inkedimmunosorbent assay，ELISIA) 法檢測(cè)血清腫瘤壞死因子 (tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白細(xì)胞介素 6(nterleukin-6，IL-6) 水平，其中 TNF-α試劑盒貨號(hào)為:LNF1-1081，IL-6試劑盒貨號(hào)為L(zhǎng)6P1-1063。

1.2.2骨密度測(cè)定：應(yīng)用法國(guó) DMS 公司生產(chǎn)的雙能 X 線(xiàn)骨密度測(cè)定儀檢測(cè)腰椎前后位BMD，自動(dòng)測(cè)出的T值，骨密度檢測(cè)人員是經(jīng)過(guò)專(zhuān)門(mén)培訓(xùn)的同一個(gè)技術(shù)人員， 骨密度分析系統(tǒng)可自動(dòng)獲得 BMD 結(jié)果。

1.2.3ALDH2基因 SNP 檢測(cè)：(1)實(shí)驗(yàn)材料：DNA提取純化試劑盒(BST01051)、免疫顯色試劑盒(BST03021)、ALDH2基因檢測(cè)試劑盒(DNA 微陣列芯片法)，國(guó)食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字 2016 第 3402573 號(hào)、全自動(dòng)雜交儀(BR-526-24)、生物芯片識(shí)讀儀(BE-2.0)、基因芯片圖像分析軟件(Arraydoctor2.0)(上海百奧科技股份有限公司)；離心機(jī)(上海嘉鵬科技有限公司，TGL-16B標(biāo)配轉(zhuǎn) 1.5*12)；PCR儀 [杭州博日科技有限公司，TC-96/G/H(b)B]。

(2)檢測(cè)過(guò)程：按照采血、提取DNA、擴(kuò)增、雜交、芯片掃描五個(gè)步驟完成，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程由武漢市第一醫(yī)院藥學(xué)部個(gè)體化實(shí)驗(yàn)室完成。靜脈采血 2 mL，加至 EDTA抗凝管中，并充分混勻，用 DNA 提取純化試劑盒提取基因組 DNA，DNA 濃度為10 ～ 60 ng/μL- 1，從 ALDH2基因檢測(cè)試劑盒中取出擴(kuò)增液進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系為 25 μL， PCR 反應(yīng)條件為：50 ℃ 5 min；94℃5 min；94 ℃ 25 s，48 ℃ 40 s，72 ℃ 30 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min；PCR 產(chǎn)物 2 ～ 8 ℃保存。從免疫顯色試劑盒中取出雜交試劑、雜交試管(含預(yù)雜交液、洗液Ⅰ、洗液Ⅱ、洗液Ⅲ)、抗體和顯色液，進(jìn)行雜交，雜交程序：預(yù)雜交液 42 ℃ 5 min；雜交 42 ℃ 30 min；洗液Ⅰ 42 ℃ 12 min；洗液Ⅱ 28 ℃ 10 min；抗體28 ℃ 20 min；洗液Ⅱ 28 ℃ 10 min；洗液Ⅲ 28 ℃ 3 min；顯色液 42 ℃ 30 min；預(yù)雜交液 28 ℃ 4 min。芯片晾干后放入 BE-2.0 生物芯片識(shí)讀儀中進(jìn)行掃描，軟件提取各點(diǎn)的信號(hào)強(qiáng)度，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，自動(dòng)輸出基因型結(jié)果。

1.3統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 兩組患者病程、生化及BMD的T值比較見(jiàn)表1

表1兩組病程、生化及BMD的T值比較

Table1Comparison of course of disease, biochemical index, and bone mineral density T-score between the two groups

組別骨質(zhì)疏松組非骨質(zhì)疏松組病程(年)7.14±0.656.88±0.77BMI (kg /m2)25.78 ± 3.0624.69±2.94SBP mmHg)135.42 ±12.46132.78±10.96DBP mmHg)8.39±9.0270.14±9.82FBG (mmol /L)5.44 ±1.255.62±1.41LDL-C (mmol /L)3.25±1.162.98±1.01T-值-3.08±1.04?-0.88±0.23

注: 與非骨質(zhì)疏松組比較，*P<0.05。

Note: Compared with the non-osteoporosis group,*P<0.05.

2.2 基因測(cè)定結(jié)果的判定， ALDH2 基因型掃描見(jiàn)圖1。

117 例骨質(zhì)疏松患者基因野生型(GG)：45 例，占 38.4%；基因突變雜合型(GA)：62例，占 53.0%；基因突變純合型(AA)：10 例，占8.6%。87 例無(wú)骨質(zhì)疏松患者基因野生型(GG)：54 例，占 62.1%；基因突變雜合型(GA)：29例，占 33.3%；基因突變純合型(AA)：4例，占4.6%。ALDH2 基因型分布符合 Hardy-Weinberg 平衡。見(jiàn)表2。

圖1 ALDH2 基因型掃描野生型純合子GG 型:Glu(504)Glu；突變型雜合子GA 型:Glu(504)Lys； 突變型純合子AA 型:Lys(504)LysFig.1 Screening of the ALDH2 genotype

表2 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)結(jié)果 (n)Table 2 Hardy-Weinberg equilibrium test results (n)

2.3 兩組ALDH2 基因型和等位基因頻率分布

兩組AA型 /GA型、GG 型頻率分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)。兩組間總的等位基因頻率分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.004)。骨質(zhì)疏松組患者AA/GA 基因型頻率為61.6%；A 等位基因頻率為35.0%，均顯著高于無(wú)骨質(zhì)疏松組(分別為37.9%，21.3%) (均P< 0.05)見(jiàn)表 3。

表3 兩組 ALDH2 基因多態(tài)性基因型和等位基因頻率的分布 [% (n) ]Table 3 ALDH2 gene polymorphism genotype and allele frequency distribution in the two groups (%, n)

2.4 兩組炎癥因子水平的比較見(jiàn)表4

表42組炎癥因子水平的比較

Table4Comparison of inflammatory cytokines between the two groups

炎癥因子骨質(zhì)疏松組非骨質(zhì)疏松組F值P值CRP8.46±1.262.62±0.846.846<0.05TNF-α6.41±0.785.02±0.696.463<0.05IL-61.86±0.440.98±0.364.592<0.05

3 討論

骨質(zhì)疏松是一種慢性代謝性骨病，該病受多種因素的影響，如激素水平、年齡、血糖、環(huán)境、基因等，有報(bào)道稱(chēng)骨質(zhì)疏松46%～62%由遺傳因素決定，38%～54%取決于周?chē)h(huán)境因素[5]。ALDH2是一種線(xiàn)粒體酶，它具有脫氫酶和酯酶等多種酶功能，是酒精代謝關(guān)鍵酶，能將乙醛氧化為乙酸，同時(shí)還能氧化四羥基壬烯醛(4-HNE)和丙二醛(MDA)等醛類(lèi)物質(zhì)，發(fā)揮間接抗氧化作用，使其轉(zhuǎn)化為無(wú)毒的相應(yīng)酸，從而損傷抗醛類(lèi)和自由氧對(duì)細(xì)胞[6]。ALDH2 其第 12 位外顯子內(nèi)的 G(鳥(niǎo)嘌呤)發(fā)生點(diǎn)突變?yōu)?A(腺嘌呤)，會(huì)使酶催化活性下降甚至喪失。ALDH2 在人群中有三種組合方式：野生型 GG；突變雜合型 GA；突變純合型 AA。ALDH-2 失活可使醛類(lèi)物質(zhì)和自由氧在體內(nèi)堆積，進(jìn)而損傷機(jī)體組織、器官等，且損傷是不可逆性的。

ALDH-2 活性下降，可能通過(guò)不能清除內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，增加EPCs 內(nèi)自由氧水平，從而激活氧化應(yīng)激的相關(guān)信號(hào)通路，破壞了線(xiàn)粒體的膜電位，減弱了 EPCs的功能，使其凋亡增加。氧化應(yīng)激是由氧自由基特別是活性氧的產(chǎn)生與抗氧化處理自由基的能力不平衡而產(chǎn)生，進(jìn)而造成對(duì)細(xì)胞的氧化損傷。孫振雙等[7]報(bào)道活性氧在線(xiàn)粒體中積累增加，造成氧化應(yīng)激，通過(guò)Wnt/β-catenin 信號(hào)通路，降低成骨細(xì)胞形成、增殖與分化，最終導(dǎo)致骨質(zhì)疏松。本文結(jié)果顯示，骨質(zhì)疏松組中AA/AG 基因型頻率和A 等位基因頻率均顯著高于無(wú)骨質(zhì)疏松組 (均P<0.05)，與上述研究結(jié)果一致，考慮A等位基因可能是老年男性骨質(zhì)疏松發(fā)病的危險(xiǎn)因素。臨床中，我們也發(fā)現(xiàn)不勝酒力、飲酒容易臉紅的人，因骨質(zhì)疏松癥導(dǎo)致骨折的風(fēng)險(xiǎn)較高，可能也與ALDH-2基因突變引起活性下降有關(guān)。故對(duì)于GA和AA型人群，應(yīng)該更加注意營(yíng)養(yǎng)均衡、避免不健康的生活方式和口服影響鈣代謝的藥物等，以減少骨質(zhì)疏松的發(fā)生。

同時(shí)由于激活氧化應(yīng)激，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞炎性浸潤(rùn)，增加了蛋白酶的分泌，產(chǎn)生了大量氧化中間產(chǎn)物，增加了細(xì)胞因子和趨化因子的釋放，破壞了機(jī)體穩(wěn)態(tài)平衡，造成器官、組織損傷。TNF-α與IL-6主要由 T 淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，有學(xué)者認(rèn)為[8]， TNF-α可能通過(guò)結(jié)合基質(zhì)細(xì)胞(stromal cells)上的TNF-α受體，使基質(zhì)細(xì)胞分泌RANKL、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophage colony-stimu-lating factor, M-CSF)和 IL-1等促進(jìn)破骨細(xì)胞形成并激活細(xì)胞因子，同時(shí)能抑制破骨細(xì)胞凋亡，延長(zhǎng)破骨細(xì)胞生存時(shí)間。表達(dá) IL-6 的轉(zhuǎn)基因老鼠表現(xiàn)出骨量減少，皮質(zhì)骨和松質(zhì)骨的微結(jié)構(gòu)被破壞，成骨細(xì)胞數(shù)量和活力下降，而骨吸收增強(qiáng)。CRP 既是炎癥介質(zhì)，又是反映炎癥的非特異性敏感指標(biāo)，Leftheriadis等[9]對(duì)腎病血透患者進(jìn)行與骨轉(zhuǎn)換相關(guān)的慢性炎癥因子研究，發(fā)現(xiàn)其 CRP明顯高于健康者。而 DingC 等[10]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)老年人循環(huán)血液中CRP水平升高可導(dǎo)致全身、脊柱和髖部的骨密度下降。多種炎癥因子可能在骨質(zhì)疏松發(fā)生發(fā)展中起到了重要作用，本研究結(jié)果也表明：骨質(zhì)疏松組的炎癥因子水平明顯高于非骨質(zhì)疏松組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

綜上所述，ALDH2 基因多態(tài)性與老年男性骨質(zhì)疏松之間具有一定的相關(guān)性，ALDH2 基因突變可能使老年男性罹患骨質(zhì)疏松的風(fēng)險(xiǎn)升高。但本研究的病例數(shù)較少，且ALDH2 基因突變?cè)黾永夏耆祟净脊琴|(zhì)疏松的風(fēng)險(xiǎn)，是否通過(guò)氧化應(yīng)激和增高炎癥因子水平的機(jī)制來(lái)實(shí)現(xiàn)的，還需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)行進(jìn)一步研究。