王亞軍 張來舉 浪萬英 宋亞文 宋凱

甘肅中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，甘肅 蘭州 730000

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)是隨著年齡的增長或婦女絕經(jīng)后，由成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞承擔(dān)的骨形成活動和骨吸收活動之間的平衡被打破，骨吸收超過骨形成而引起的以骨量減少、骨強(qiáng)度降低、骨脆性增加為特征，并伴隨骨組織顯微結(jié)構(gòu)退化的全身代謝性骨病[1-3]。PMOP早期無明顯癥狀，故不會引起患者的注意，是一種易被人們忽視的隱性、慢性的流行性疾病[4-5]，隨著社會的老齡化，PMOP發(fā)病率和骨折率呈上升趨勢，本疾病引起的骨痛、骨骼變形及并發(fā)癥嚴(yán)重影響老年人的身體健康和生活質(zhì)量，PMOP的危害及防治已成為當(dāng)今熱點(diǎn)問題之一[6]。以往，研究者認(rèn)為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的首要原因是由于雌激素水平的下降[7-8]，但近年來已有越來越多的實(shí)驗研究結(jié)果表明，骨免疫異常、慢性炎性反應(yīng)、骨髓微循環(huán)障礙以及氧化應(yīng)激等也可導(dǎo)致PMOP，提示PMOP的發(fā)病機(jī)制是多靶點(diǎn)、多因素、多維度的，不再單純以雌激素為中心，最終，無論何種機(jī)制都是通過影響成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的來源、分化增殖、凋亡及其功能而實(shí)現(xiàn)的。然而，任何干預(yù)手段最終均通過調(diào)節(jié)相關(guān)的信號傳導(dǎo)通路發(fā)揮治療作用，針灸療法亦如此[9]。近年來，針灸療法在治療PMOP的臨床和實(shí)驗研究中取得了一定進(jìn)展，并以其安全簡便、無不良反應(yīng)和療效顯著等優(yōu)點(diǎn)而日益受到重視，但在療效評價和治療機(jī)制方面仍存在許多未解決的問題[10-11]。本實(shí)驗通過觀察電針對去卵巢骨質(zhì)疏松模型大鼠Wnt3a和β-catenin的蛋白及基因表達(dá)的影響，探討針刺干預(yù)后Wntβ-catenin信號傳導(dǎo)通路的變化規(guī)律，闡明針刺是否通過調(diào)節(jié)這一信號通路系統(tǒng)達(dá)到治療的目的，以期從分子水平揭示針刺對PMOP的治療機(jī)制，為針灸治療PMOP的臨床應(yīng)用提供科學(xué)實(shí)驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗動物及分組

選取60只SPF級雌性SD大鼠，日齡60 d左右，體質(zhì)量180 g～220 g，飼養(yǎng)溫度(22±2)℃，濕度50%～70%，飲用純凈水，食用標(biāo)準(zhǔn)鼠類飼料，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研動物實(shí)驗中心提供[許可證號：SCXK(甘)2011-0001]，實(shí)驗動物質(zhì)量合格證編號：62001000000276。按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、假手術(shù)組、模型組、藥物組、針刺組，各12只。

1.2 主要儀器、試劑、針具及藥物

實(shí)時熒光定量PCR儀(ABI，美國)；相差顯微鏡(OLYMPUS，日本)；鋸式切片機(jī)(Leica公司，德國)；Wnt3a一抗(Abcam，美國)；Beta-catenin(Abcam，美國)；免疫組織化學(xué)染色二抗試劑盒(博士德公司)；Total RNA提取試劑盒、Prime ScriptTM reagent逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Prime Ex TapTM ⅡPCR 試劑盒均購自TakaRa公司；引物由大連寶生物公司設(shè)計并合成；戊酸雌二醇片(拜耳醫(yī)藥保健有限公司，生產(chǎn)批號：199A3)；水合氯醛(保定市凌業(yè)商貿(mào)有限公司，生產(chǎn)批號：G3045)；針灸針(Ф0.35×13 mm，蘇州華佗醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn))；電針儀(上海華誼醫(yī)用儀器有限公司，型號SDZ-Ⅱ)。

1.3 實(shí)驗方法

1.3.1骨質(zhì)疏松模型建立:按照文獻(xiàn)[12]方法造模:將模型組、藥物組、針刺組大鼠以10%水合氯醛溶液(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉，腹位固定，在其最末肋骨下，腋中線與距脊柱外側(cè)約1 cm交叉處備皮、消毒，切開皮膚約1～1.5 cm，依次切開肌肉，剪開腹膜進(jìn)入腹腔，用小鑷子輕輕將白色發(fā)亮脂肪團(tuán)拉出切口外，分離脂肪團(tuán)，便可見到粉色菜花樣卵巢，先將卵巢下端輸卵管用絲線結(jié)扎，然后摘除雙側(cè)卵巢，觀察無異常后，切口分層縫合，外部敷以消炎粉?？瞻捉M不做任何處理，假手術(shù)組只暴露雙側(cè)卵巢但不切除。造模后飼養(yǎng)13周，經(jīng)骨密度和骨礦物含量檢測，結(jié)果顯示骨質(zhì)疏松模型建立成功，見表1。

分組nBMDBMC空白組120.176±0.00919.38±0.031模型組120.151±0.011?17.83±0.026▲

注：與空白組比較:*P<0.05；▲P<0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

Note: Compared with the blank group,*P<0.05,▲P<0.05.

1.3.2干預(yù)方法:針刺組選取“腎俞”、“脾俞”、“三陰交”、“足三里”，穴位定位參照《實(shí)驗針灸學(xué)》[13]類比取穴，將大鼠穴位局部剪去鼠毛，穴位和針具常規(guī)消毒后，用0.35×13 mm不銹鋼毫針快速刺入皮下一定深度，接入電針儀，頻率為2 Hz，斷續(xù)波，刺激強(qiáng)度1.0mA，以局部見肌肉輕微收縮為佳[14-15]，每次電針刺激15 min，1次/1 d，連續(xù)治療5 d，間隔2 d，20 d為1個療程，治療3個療程，同時灌服與藥物組相同體積的蒸餾水；藥物組大鼠給予1 mL/100 g體質(zhì)量的0.02 mg/mL戊酸雌二醇水溶液灌胃(給藥劑量按照大鼠體表面積比值折算而成)[12,16]，療程同針刺組；空白組不予處理，常規(guī)飼養(yǎng)；假手術(shù)組和模型組大鼠灌服與藥物組相同體積的蒸餾水，療程同針刺組。各組大鼠每周稱重1次，以此調(diào)整給藥劑量。治療期滿3個療程后采用10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉并處死各組大鼠，分離出股骨和脛骨，剝除附著的軟組織，用經(jīng)生理鹽水浸透的醫(yī)用紗布包裹左側(cè)脛骨和右側(cè)股骨，放置于-20 ℃冰箱中保存待用。

1.4 指標(biāo)檢測與方法

1.4.1RT-PCR分析法檢測Wnt3a和β-catenin mRNA表達(dá):(1)總RNA提?。簩⑿迈r的右側(cè)股骨加入液氮，研磨至粉末后，家兔Trizol裂解液室溫放置5～10 min使細(xì)胞充分裂解后，加入250 μL預(yù)冷過的氯仿，蓋上離心管蓋，用手劇烈震蕩20 s后室溫放置5 min左右，12000rpm 4 ℃離心15 min，此時樣品分為三層，取最上一層上清液(注意別吸到蛋白層)，加入400 μL異丙醇，輕輕上下顛倒混勻15次，室溫放置30 min左右。12000 rpm 4 ℃ 離心15 min，得到白色沉淀，棄上清后沿離心管壁加入75%的乙醇1 mL進(jìn)行沉淀的清洗，12000 rpm 4 ℃離心5 min。棄上清，室溫干燥沉淀2～5 min后溶解沉淀，紫外分光光度計檢測所提取的RNA溶液在260 nm、280 nm、320 nm的吸光值，計算RNA純度及濃度。

(2)總mRNA的逆轉(zhuǎn)錄：逆轉(zhuǎn)錄過程根據(jù)Prime ScriptTM reagent逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明書進(jìn)行，PCR擴(kuò)增體系為1步PCR，37℃15 min，最后85℃5 s使酶變性失活，然后4 ℃保存10 min。引物的設(shè)計與合成由寶生物(大連)公司完成。

Wnt3a： F 5’-AAAGCACGGTGTTGGG -3’；R 5’-CAGAGGATTCGGGATC -3’

β-catenin： F 5’-CGGTTAGAAGGGGTTA-3’；R 5’-GACGGTCTCGGTGTGT-3’

GAPDH：F 5’-TATCGGACGCCTGGTTAC-3’；R 5’-CTGTGCCGTTGA ACTTGC-3’

(3)PCR檢測：實(shí)時熒光定量PCR過程按照TakaRa Prime Ex TapTM ⅡPCR 試劑盒操作說明進(jìn)行。PCR反應(yīng)條件：第一步95 ℃預(yù)變性30 s；第二步95 ℃變性5 s，第三步60 ℃退火40個循環(huán)，每個循環(huán)31 s，最后進(jìn)行溶解階段。所有結(jié)果經(jīng)GAPDH內(nèi)參校正后，ΔΔCt法計算最終結(jié)果并采用2-ΔΔCt表示。

1.4.2免疫組化法檢測Wnt3a和β-catenin 蛋白表達(dá)

(1)切片：將新鮮凍存的左側(cè)脛骨置于飽和EDTA溶液中進(jìn)行脫鈣，20天后，檢測脫鈣效果；將脫鈣后的骨組織進(jìn)行脫水，石蠟包埋后，切片，組織厚度不超過50 μM；將制備好的切片進(jìn)行脫蠟至水；沸水浴5 min進(jìn)行抗原修復(fù)；透膜：加入0.02% TritonX-100 10 min，PBS清洗3次，5 min/次。

(2)免疫組織化學(xué)染色：封閉：PBS清洗3次，5 min/次，加入3%H2O210 min，PBS清洗3次，5 min/次，加入5% 胎牛血清(FBS)封閉1 h；孵育一抗：吸掉FBS，加入一抗，4 ℃過夜；孵育二抗：PBS清洗3次，5 min/次，加入二抗，37 ℃培養(yǎng)箱孵育0.5 h；PBS清洗3次，5 min/次，加入SABC 37 ℃ 培養(yǎng)箱孵育0.5 h；顯色：PBS清洗2次，5 min/次，加入DAB顯色劑，顯色1～5 min，出現(xiàn)棕黃色即可；復(fù)染：蒸餾水清洗2次，5 min/次，蘇木素復(fù)染1 min，蒸餾水漂洗，加入鹽酸酒精，立即洗掉，蒸餾水清洗15 min；脫水封片：分別浸入80%乙醇、95%乙醇、100%乙醇、二甲苯各1 min，脫水，樹脂封片至干凈載玻片，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠股骨Wnt3a mRNA表達(dá)水平

如圖1所示，模型組Wnt3a mRNA表達(dá)量最低,與空白組和假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；經(jīng)藥物或針刺干預(yù)后，Wnt3a mRNA表達(dá)顯著升高，與模型組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖3 各組大鼠Wnt3a 蛋白表達(dá)與模型組比較，**P<0.05Fig.3 Protein expression of Wnt3a in each group Compared with model group,**P<0.05

圖1 各組大鼠Wnt3a mRNA相對表達(dá)量與模型組比較，**P<0.05Fig.1 The relative mRNA expression of Wnt3a in each group Compared with model group,**P<0.05

2.2 各組大鼠股骨β-catenin mRNA表達(dá)水平

如圖2所示，模型組β-catenin mRNA表達(dá)量最低,與空白組和假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；經(jīng)藥物或針刺干預(yù)后，β-catenin mRNA表達(dá)顯著升高，與模型組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 各組大鼠β-catenin mRNA相對表達(dá)量與模型組比較，**P<0.05Fig.2 The relative mRNA expression of β-catenin in each group Compared with model group,**P<0.05

2.3 各組大鼠脛骨Wnt3a 蛋白表達(dá)水平

如圖3所示，模型組Wnt3a 蛋白表達(dá)量最低,與空白組和假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；經(jīng)藥物或針刺干預(yù)后，Wnt3a 蛋白表達(dá)顯著升高，與模型組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.4 各組大鼠脛骨β-catenin蛋白表達(dá)水平

如圖4所示，模型組β-catenin蛋白表達(dá)量最低,與空白組和假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；經(jīng)藥物或針刺干預(yù)后，β-catenin蛋白蛋白表達(dá)顯著升高，與模型組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖4 各組大鼠β-catenin蛋白表達(dá)與模型組比較，**P<0.05Fig.4 Protein expression of β-catenin in each group Compared with model group,**P<0.05

3 討論

關(guān)于PMOP的中醫(yī)病因病機(jī)及辨證分型由于缺乏經(jīng)典理論的指引，臨床上尚缺乏統(tǒng)一的診斷標(biāo)準(zhǔn)，歷代醫(yī)家多認(rèn)為其與腎、脾、肝、瘀密切相關(guān)，基本病機(jī)是脾腎虧虛、骨枯髓痿為本、邪阻經(jīng)絡(luò)為標(biāo)，肝失疏泄是關(guān)鍵，血瘀是其促進(jìn)因素，當(dāng)以補(bǔ)腎健脾疏肝，輔以通絡(luò)為治療原則[17]。中醫(yī)理論認(rèn)為，腎主骨藏精，腎精對骨的發(fā)生、成長及退化起著重要作用；脾主四肢，為百骸之母，氣血生化之源，脾化生精微借助于腎陽的溫煦，而腎中精氣依賴于水谷精微的充養(yǎng)，二者相互資養(yǎng)，互為因果，脾虛可導(dǎo)致腎虛及骨髓空虛，從而引起PMOP的發(fā)生。脾俞、腎俞具有健脾補(bǔ)腎的作用，三陰交為肝脾腎三經(jīng)的交會穴，可補(bǔ)益三臟之虛，足三里，為胃之下合穴有健脾和胃、扶正培元、通經(jīng)活絡(luò)、升降氣機(jī)的功效，為全身強(qiáng)壯要穴，諸穴相配可有效改善PMOP的臨床癥狀，從而達(dá)到較好的治療效果。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，PMOP發(fā)病機(jī)制是由成骨細(xì)胞骨形成功能絕對或相對不足，破骨細(xì)胞骨吸收功能亢進(jìn)，骨吸收超過骨形成而引起的。因此，西醫(yī)治療PMOP多采用骨形成促進(jìn)劑和骨吸收抑制劑，包括雌激素類、降鈣素類、甲狀旁腺激素類、活性維生素D等[18]，上述治療方法雖有效果，但存在遠(yuǎn)期療效欠佳、副作用多等不足。大量臨床實(shí)踐和實(shí)驗研究的結(jié)果表明，針刺能有效增加大鼠骨密度，阻止骨量降低，減緩骨力學(xué)的退變，增強(qiáng)骨強(qiáng)度[19-21]。為進(jìn)一步從分子水平探討針刺治療PMOP的作用機(jī)制，本實(shí)驗以RT-PCR法和免疫組化技術(shù)檢測去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠Wnt3a和β-catenin基因和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，模型組Wnt3a和β-catenin基因和蛋白表達(dá)水平均明顯低于空白組和假手術(shù)組(P<0.05)；補(bǔ)腎健脾穴位電針或戊酸雌二醇水溶液灌胃可明顯提高去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠Wnt3a和β-catenin基因和蛋白表達(dá)水平，提示W(wǎng)ntβ-catenin信號傳導(dǎo)途徑對成骨細(xì)胞分化增殖起著十分重要的作用。其中Wnt3a蛋白是Wntβ-catenin信號通路的起始因子,β-catenin是Wntβ-catenin信號通路中最關(guān)鍵因子[22]。 本實(shí)驗結(jié)果提示，針刺PMOP可能是通過上調(diào)Wnt3a和β-catenin的基因和蛋白表達(dá)從而調(diào)節(jié)Wntβ-catenin信號通路，以此調(diào)節(jié)骨重建系統(tǒng)的平衡，從而達(dá)到預(yù)防和治療PMOP的效果，該實(shí)驗結(jié)果為臨床針灸治療PMOP提供了科學(xué)的理論依據(jù)。

針灸的療效具有整體性、多維度、多靶點(diǎn)、多目標(biāo)的調(diào)節(jié)作用的特點(diǎn)，隨著對針刺治療產(chǎn)生的全身的、整體的調(diào)節(jié)作用，深入探究以及現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗技術(shù)方法的發(fā)展，對PMOP的認(rèn)識已達(dá)到細(xì)胞分子水平，但仍有些問題值得思考：1.研究發(fā)展緩慢，一味地重復(fù)相同指標(biāo)且研究層次較低，應(yīng)針對以往未涉及的實(shí)驗環(huán)節(jié)，如機(jī)制研究。2.研究治療周期較短，針灸對PMOP遠(yuǎn)期療效尚不能確定，由于PMOP是一個長期形成的過程，治療也同樣需要長期的過程，因此，今后的研究可考慮采用更長的研究周期，這樣能更好地凸顯針刺的治療效果。3.治療PMOP方法繁雜多樣，新的治療方法不斷涌現(xiàn)，如何找到一種既突出本方法特色又對其特異性及所針對適應(yīng)證型規(guī)律性進(jìn)行總結(jié)和概括的優(yōu)化治療方案，仍有待進(jìn)一步探討?？傊?，針灸治療PMOP的研究任重道遠(yuǎn)，有待向更系統(tǒng)、更深領(lǐng)域發(fā)展。