黃 鑫，劉子欣，胡利明

北京工業(yè)大學生命科學與生物工程學院，北京市環(huán)境與病毒腫瘤學重點實驗室，北京 100124

熒光探針在生物、食品安全、環(huán)境、醫(yī)學檢測與成像等方面越來越受到人們的重視。近年來，納米材料的引入，具有特異性識別功能的熒光探針在生物醫(yī)學、臨床診斷以及癌癥治療等方面展現(xiàn)出了巨大的潛力［1-3］。分子熒光探針具有靈敏度高、操作簡便、時空分辨能力強、膜穿透性好等特點，可進行細胞、活體組織熒光檢測研究。與熒光成像技術結合，分子熒光探針適用于生物體系中目標分子的實時原位無損檢測，可實現(xiàn)活細胞與活體中生物分子及其生物過程的監(jiān)測。目前，分子熒光探針已成為生命科學及疾病診斷等領域不可或缺的研究手段，在細胞信號通路研究、疾病早期診斷、成像引導手術治療等領域發(fā)揮著越來越重要的作用。分子熒光探針的設計、合成及其生物成像的應用已經(jīng)成為當前跨學科的前沿交叉研究領域［4-5］。

細胞內各種活性生物小分子和酶參與各種生物化學反應，影響細胞的多種生理過程?；钚陨镄》肿又饕ㄟ€原性物質，如谷胱甘肽、半胱氨酸、硫化物等；活性氧類物質如過氧化氫、超氧陰離子、羥基自由基等；活性氮類物質如一氧化氮、亞硝酰等；金屬陽離子如 K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Fe2+等；陰離子如等；酶如硝基還原酶、細胞色素P450、酪氨酸酶等。這些活性小分子或酶參與基因表達、細胞凋亡調控、神經(jīng)信號傳遞、細胞信號轉導、離子通道調節(jié)等過程。

按識別基團與被測物的響應類型可將探針分為三類：反應型熒光探針、配位型（或稱鰲合型）熒光探針和專用熒光探針，如線粒體標記探針、離子通道熒光探針、受體熒光探針等［6-8］。

反應型的熒光探針主要通過探針與目標物質發(fā)生不可逆的化學反應，從而導致其熒光性質發(fā)生變化，實現(xiàn)疾病相關標志物的檢測［9］。相較于其他類型，這類探針的主要優(yōu)勢在于：可以與很多特異性的化學反應原理結合來設計探針結構。所以這類熒光探針在應用時，不僅選擇性優(yōu)異，還具有更高的靈敏度。反應型熒光探針按作用機理主要分為三類：“Turn-on”型，“Turn-off”型和比率型，如圖1所示。

本文主要介紹近年來基于反應的小分子熒光探針在疾病檢測研究中的進展。根據(jù)其應用的對象不同進行分類介紹，并分析各種探針的反應類型、作用機理以及設計思路。根據(jù)發(fā)展現(xiàn)狀和各類探針的優(yōu)缺點，提出在發(fā)展過程中存在的問題以及對今后趨勢進行展望。

1 反應型陰離子熒光探針

氟離子在牙齒保護方面有很重要的作用，然而氟化物一旦過多對人體危害也很大，氟離子可以滲透到人體內，導致氟中毒、尿石癥或癌癥。因此，監(jiān)測氟離子在生物或環(huán)境樣品中含量十分重要。Hu等［10］設計、合成了一種用于氟離子的檢測的羥基喹啉類熒光探針，如圖2所示。

圖1 反應型熒光探針的一般作用機制示意圖：（a）“Turn-on”型探針的機制，（b）“Turn-off”型和比率型熒光探針的機制Fig.1 Schematic diagram of general mechanisms of reaction-based fluorescent probes：（a）“Turn-on”type ，（b）“Turn-off”and ratio types

該探針QF基于6-羥基-喹啉-2-苯并噻唑（b-hydroxyl-quinoline-z-benzothiazole，HQB）作為熒光團，叔丁基二苯基甲硅烷基團用于特異性識別氟。QF作為比率型熒光探針，特點在于熒光團HQB在連接硅烷基后，分子內電荷轉移效應（intra?molecular charge transfer，ICT）被抑制，熒光減弱。氟離子可以特異性使“硅醚鍵”發(fā)生斷裂，出現(xiàn)ICT效應，熒光強度增強。這種熒光探針可應用于體外水樣品的檢測，也可在HeLa細胞和斑馬魚中實現(xiàn)氟離子的雙光子顯微成像，間接測定其含量。

圖2 檢測氟離子的熒光探針Fig.2 Fluorescent probe for detecting fluoride ions

基于無機氰化物的劇毒屬性，極低濃度可造成魚類或哺乳動物等死亡。Xu等［11］設計、合成了一種高選擇性的比率型氰化物熒光探針N2。探針以萘二甲酰亞胺作為熒光母核，甲基化三氟乙酰胺基團作為識別CN-的受體。甲基巧妙地取代三氟乙酰胺基中的“活性”H原子，提高了識別基團的選擇性。當氰基陰離子進攻探針中三氟乙酰胺基的羰基而發(fā)生“親核加成”反應時，探針的ICT效應增強伴隨光譜紅移并發(fā)射黃光。熒光探針N2應用于痕量氰化物檢測，能夠發(fā)生裸眼可見的變化。該探針不足是：探針的吸收和發(fā)射波長均在短波長區(qū)域，可能會限制其在成像領域應用，且該研究未涉及細胞水平和活體內檢測。

圖3 檢測氰離子的熒光探針Fig.3 Fluorescent probe for detecting cyanide ions

2 反應型金屬陽離子熒光探針

許多金屬陽離子與生理或病理發(fā)生過程相關，實時監(jiān)測這些離子的濃度對疾病診斷和預防十分重要。過去幾年，該領域取得了許多進展，發(fā)現(xiàn)一些高靈敏度和選擇性的探針并用于活體金屬離子的監(jiān)測。

威爾遜病是一種銅離子在組織中積聚相關的疾病。Liu等［12］設計、合成了一種針對銅離子的近紅外羅丹明類探針，如圖4所示。目前，多數(shù)基于銅的熒光探針波長檢測范圍都在紫外和可見光范圍內［13-18］，這就導致此類探針穿透深度有限且難以與背景熒光區(qū)分，在模型動物中使用受到很大限制。Liu等選擇近紅外羅丹明衍生物作為熒光母核，利用肼對其羧基進行修飾，設計合成出分子內螺環(huán)探針NRh，在激發(fā)光作用下無熒光發(fā)射。銅離子與探針作用后，酰肼鍵發(fā)生水解斷裂，螺環(huán)開環(huán)使得熒光強度增強（約600倍）。該探針不僅用于細胞水平的銅離子含量測定，還可以應用于組織、動物及人的體液，為威爾遜病的診斷提供了有效手段。

圖4 檢測銅離子的熒光探針Fig.4 Fluorescent probe for detecting copper ions

重金屬離子是環(huán)境污染、急性中毒等疾病的重要源頭，對其進行實時監(jiān)控十分必要。汞或汞離子是典型的污染物，不論汞蒸氣還是可溶性汞鹽，即使在低濃度下也會對人體和其他生命體產(chǎn)生極大的毒性，因此環(huán)境和生物樣品中痕量Hg2+離子的檢測十分重要。Huang等［19］設計、合成了一種氨基萘類探針（SAN）用于汞離子的檢測。氨基萘類熒光物質主要依賴分子內ICT效應發(fā)光，而經(jīng)過1，2-乙二硫醇修飾后ICT效應被抑制，熒光大大減弱。當探針（SAN）與汞離子作用，縮酮鍵水解，ICT效應不再被抑制，熒光強度增強。憑借雙光子熒光探針的優(yōu)點，SAN可以檢測活組織中痕量的Hg2+，如圖5所示。該探針的不足是對銀離子和鉛離子的抗干擾能力略差于其它離子。

圖5 檢測汞離子的熒光探針Fig.5 Fluorescent probe for detecting mercury ions

在過渡金屬中，鐵在氧攝取、代謝、電子轉移等生化反應中起著至關重要的作用。另一方面，過量的Fe3+與各種疾病如癌癥、肝炎、肝臟或心臟和胰腺功能障礙等有關。近年來，國內外利用熒光探針對Fe3+的定性定量檢測開展了大量研究，難點在于避免 Cr3+和 Hg2+的干擾。Belfield 等［20］設計并合成了一種用于檢測Fe3+的新型硼二吡咯甲烷（bipyrrome theneboron difluorids，BODIPY）熒光開啟型傳感器，如圖6所示。探針選擇BODIPY熒光母核連接新型Fe3+識別基團，該識別部位由雙環(huán)穴狀配體組合而成，具有高選擇性和可逆性。探針可應用于水體系中并能夠檢測活細胞中的Fe3+。

圖6 用于檢測鐵離子的熒光探針Fig.6 Fluorescent probe for detecting ferric iron ions

3 反應型活性氧熒光探針

人體內發(fā)生各種生化反應，其中活性氧（reac?tive oxygen species，ROS）發(fā)揮著十分重要的作用。在正常生理濃度范圍內，活性氧不僅參與細胞的氧化還原反應，還與細胞的生長、凋亡密切相關［21］。當ROS水平超過機體抗氧化防御能力時，會引起氧化應激，最終導致疾病的發(fā)生，如神經(jīng)退行性疾病、代謝類疾病、心血管疾病以及癌癥等。近年來，針對細胞內活性氧類物質檢測的熒光探針不斷被報道。ROS有很多種類且能相互間轉化，如次氯酸根、單線態(tài)氧、羥基自由基、過氧化氫、超氧根自由基等，這些自由基反應活性高、壽命短，一般的分析方法難免選擇性差、副反應較多等缺點，而新型熒光探針能克服這些缺點。

圖7 檢測次氯酸根離子的熒光探針Fig.7 Fluorescent probe for detecting hypochlorite ions

Hu等［21］設計、合成了一種基于亞甲藍的近紅外熒光探針，用于選擇性檢測次氯酸根離子。通過將乙?；雭喖姿{框架中合成乙?；瘉喖姿{，可以特異性識別外源性和內源性ClO-。該探針的檢測限為0.1 μmol/L，與次氯酸根離子作用后的熒光強度增加約200倍，其優(yōu)點在于原料廉價且安全、合成簡單、檢測迅速而且在近紅外發(fā)射避免了背景干擾。該探針不足在于這類熒光母核的量子產(chǎn)率較低，導致響應時熒光增強倍數(shù)不高。

細胞中的H2O2是通過超氧岐化酶催化或者自發(fā)歧化形成的，而體內的抗氧化性酶，如過氧化物酶（peroxiredoxin，Prx）和谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GPx），則將體內的 H2O2濃度保持在比較穩(wěn)定的范圍［22］。實時監(jiān)測過氧化氫的濃度在化學、生物、醫(yī)學等多領域都十分重要。Lin等［23］利用H2O2對氧鎓的親核性，設計了近紅外熒光探針，如圖8所示。探針BC與H2O2作用，水解得到香豆素羧酸，從而實現(xiàn)了H2O2的熒光識別。并且成功應用于斑馬魚中H2O2熒光成像。

Stains等［24］通過對羅丹明進行結構改造，將母核中的氧原子換成硅酸得到探針SiOH2R，如圖9所示。該探針可對H2O2高效識別且具有較強的細胞膜滲透能力，與過氧化氫作用后的斯托克位移（Stoke's Shift）很大，使其在細胞內具有良好的成像能力。

圖8 檢測過氧化氫的熒光探針Fig.8 Fluorescent probe for detecting H2O2

圖9 熒光探針SiOH2R被過氧化氫氧化后的顏色和熒光變化Fig.9 Changes of color and fluorescence of probe-SiOH2R with the oxidation by H2O2

另一重要的活性氧物質是羥基自由基（hydrox?yl radical，?OH），它在人體內參與DNA和蛋白質等生物大分子的降解過程，并在癌癥放射治療中發(fā)揮著重要作用。Xu等［25］報道了一種新型熒光探針MPT-Cy2顯示出活細胞和細菌中內源性?OH成像能力，探針MPT-Cy2與羥基自由基作用后熒光增強顯著，如圖10所示。該探針可用于產(chǎn)生內源性?OH的斑馬魚體內成像，還可用于定性檢測各種細菌受到藥物刺激后的?OH升高水平。

圖10 探針MPT-Cy2的結構和與·OH的反應式Fig.10 Structure of probe MPT-Cy2 and reaction with·OH

Cai等［26］研究用于清除細胞內金黃色葡萄球菌的新型靶向材料，如圖11所示。該工作設計、合成了由葉綠素-多肽-甘露糖三部分組成的綴合物，并以該綴合物與銅離子自組裝形成的配合物二聚體作為治療劑。進入免疫細胞的二聚體光敏劑在650 nm激光照射下能高效地產(chǎn)生活性氧，進而將免疫細胞內部的細菌予以清除。

隨后，Cai等［27］報道了一種自組裝增強光聲信號多肽分子用于細菌感染生物成像檢測。這種光聲劑可以通過主動靶向、分子剪裁和順序自組裝的“動態(tài)過程”特異性地積聚在活化的巨噬細胞內。該光聲劑的光聲信號對細胞內感染的巨噬細胞具有很高的特異性，比主動靶向控制劑的信號增加超過2倍。該方法可通過體內光聲信號檢測來早期預警細菌感染，為頑固性感染疾病的檢測和治療提供了方法。

4 反應型酶類熒光探針

酶在維持生物體內穩(wěn)態(tài)與生命活動的正常運行方面發(fā)揮著重要作用。某些特定酶含量及活性的異常與許多疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關。因此，生物體內特定酶的實時原位檢測具有重要的意義。反應型小分子熒光探針因具有選擇性好、靈敏度高及合成方法簡便等優(yōu)點，近年來研究者設計合成了大量的可用于生物體系內酶識別熒光探針，如酸性鞘磷脂酶、堿性磷酸酶和酪氨酸酶等的熒光檢測探針。

圖11 光動力二聚體靶向清除細胞內的金黃色葡萄球菌Fig.11 Intracellular staphylococcus aureus killed by targeting photodynamic dimers

酸性鞘磷脂酶（acid sphingomyelinase，ASM）存在于所有真核細胞中，相關研究表明，ASM與急性肺損傷、癌癥、腫瘤轉移及重度抑郁癥等疾病的發(fā)生密切相關［28-31］。因此，ASM已被看作為多種疾病的生物標志物。

Pinkert等［32］報道了一種基于熒光共振能量轉移（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）的新型小分子熒光探針，如圖12所示。該探針分子以7-甲氧基-3-羧基香豆素衍生物（7-methoxy?coumarin-3-carboxylic acid，MCC）作為 FRET供體熒光基團，以硝基苯并噁二唑（nitrobenzoxadiazole，NBD）作為FRET受體熒光基團，該探針可被鞘磷脂衍生物識別并發(fā)生酶切反應，隨著供、受體熒光基團距離的增大，F(xiàn)RET轉移的效率顯著下降，導致在550 nm處的熒光強度逐漸降低，400 nm處的熒光強度逐漸增加。因此，該探針能夠在活細胞中特異性檢測ASM。

堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）能夠催化堿性介質中磷酸基團的水解，是一種必需的酶。ALP水平的異常與多種疾病如乳腺癌、前列腺癌、糖尿病、骨質疏松、骨癌和肝功能異常等的發(fā)生發(fā)展相關［33-36］。因此，建立一種可靠、簡便且靈敏的ALP分析方法，對于進一步理解ALP在相關生物過程和臨床實踐中的作用具有重要意義。

Li等［37］設計了一種用于檢測ALP活性的近紅外熒光探針，如圖13所示。這種探針以半花菁染料為熒光團，以磷酸基團為識別基團。由于磷酸基團的淬滅作用，探針本身是無熒光的。體系中存在的ALP能夠除去磷酸基團，使得探針在738 nm處產(chǎn)生熒光發(fā)射峰。該探針對ALP高度靈敏，能夠被應用于生物樣品中內源性ALP活性的檢測。

圖12 基于FRET熒光探針的酸性鞘磷脂酶活性檢測：（a）由ASM催化的脂-水界面處的鞘磷脂水解，（b）合成的探針NBD和MCC紅色箭頭表示ASM水解位點Fig.12 Detection of ASM activity by FRET-based fluorescence probe ：（a）Sphingomyelin hydrolysis at the lipid-water interface catalyzed by ASM，（b）Synthesized NBD and MCC probes.The red arrow indicates the ASM hydrolysis site

圖13 體內ALP活性檢測的熒光探針Fig.13 Fluorescence probe for detection of ALP activity in vivo

近年來，Li等［38］針對酪氨酸酶（tyrosinase，TYR）設計合成了幾種反應型熒光探針。由于酪氨酸酶在黑色素瘤細胞中過量表達，并且其與腫瘤的惡性侵襲能力正相關，因此酪氨酸酶被認為是黑色素瘤的生物標志物。在發(fā)現(xiàn)、診斷黑色素瘤進程中，設計、合成選擇性較高的酪氨酸酶熒光探針具有十分重要的意義。首先，設計合成了香豆素類TYR熒光探針，并對其生物學效應進行研究。熒光母核選用7-氨基-4-三氟甲基香豆素基團，如圖14所示，連接4種不同的酶識別基團合成出四種TYR熒光探針（F1-F4），經(jīng)過篩選發(fā)現(xiàn)探針F2性質具有優(yōu)良的熒光性質［39］。由于7-氨基-4-三氟甲基香豆素基團的斯托克位移較長，能夠有效地避免光學成像過程中的自淬滅和增益誤差［40］，該探針得以在細胞水平上高選擇性、高靈敏度地檢測TYR。這類探針的不足是在分子水平和細胞水平檢測TYR活力的時間較長，增加了檢測的難度和準確度。

圖14 在酪氨酸酶存在下探針F2的降解Fig.14 Degradation of probe F2 in the presence of TYR

Li等［41］還通過計算該類探針水解過程中吉布斯自由能的變化，優(yōu)選釋放最大自由能的“脲”結構，如圖15所示。以“試鹵靈”為熒光基團設計了一種新型TYR熒光探針Res1。在水溶液中，Res1有更好的靈敏度、選擇性以及更快的反應速率。但是在細胞水平進行測定時，其響應時間較長，所以考慮對探針Res1的熒光母核結構進行改變。該探針的不足在于其分子內含有3個酚羥基，極性較大，容易在堿性環(huán)境中電離生成酚羥基負離子。而酚羥基的理化性質會影響探針的細胞膜穿透能力，進而影響探針發(fā)揮作用的時效性。

圖15 新型TYR熒光探針Res1的設計Fig.15 Design of a novel fluorescent probe Res1 for TYR

采用吩噻嗪類熒光母核合成了近紅外TYR探針MB1。該探針不但可以用于診斷，還可以殺傷黑色素瘤細胞，如圖16所示。探針MB1可以選擇性地對黑色素瘤細胞快速響應［42］，解決了前期研究中的不足。另外，在近紅外區(qū)域激光照射下，探針還可通過生成單線態(tài)氧達到殺傷黑色素瘤細胞目的。

圖16 在酪氨酸酶存在下探針MB1的降解Fig.16 Degradation of probe MB1 in the presence of TYR

5 反應型谷胱甘肽熒光探針

谷胱甘肽（glutathione，GSH）是真核細胞中含量最多的硫醇類化合物，其在生物體的許多生理過程中發(fā)揮著重要作用。GSH水平的異常改變與兒童發(fā)育遲緩、肝功能損傷、皮膚病、艾滋病、阿爾茨海默病、癌癥、糖尿病、心血管疾病等直接相關［43-44］，所以細胞內谷胱甘肽含量的檢測對細胞功能研究和病理分析都具有重要的意義。以熒光探針為基礎的熒光分析法因其操作簡便、靈敏度高和專一性強等優(yōu)點而備受大家關注，并且有機小分子熒光探針還可以應用于活體細胞和生物體的成像技術。

Wu等［45］近期設計并合成了一種GSH觸發(fā)的新型“診療合一”的生物探針，如圖17所示。該探針主要由抗癌藥物喜樹堿、雙光子近紅外熒光團和對硫醇類化合物特異性響應的二硝基苯磺?；鶊F，通過一個間隔基團相互連接所組成。由于二硝基苯磺?；娮犹匦裕梢酝ㄟ^光致電子轉移（photoincluced electron transfer，PET）/ICT 效 應使近紅外熒光團發(fā)生淬滅。體系中存在的GSH能夠觸發(fā)一系列反應并將喜樹堿和近紅外熒光團共同釋放出來，由于光致電子轉移作用的消失，熒光團的熒光逐漸恢復。因此該探針能夠實現(xiàn)基于GSH響應的腫瘤診斷及治療，將其應用在細胞與小鼠模型上，效果十分明顯。

Jiang等［46］報道了一種能夠對活細胞中GSH動態(tài)變化進行實時定量監(jiān)測的熒光探針，該探針與GSH之間的反應基于可逆的Michael加成反應，如圖18所示。該探針引入了吸電子基團氰基，使解離平衡常數(shù)在合適的范圍內。與此同時，借鑒前人的研究工作［47］，用四元氮雜環(huán)丁烷基取代二乙基氨基，顯著提高了探針的量子產(chǎn)率。探針結構中羧基的引入使其具備了較好的水溶性，確保了探針在細胞中的均勻分布。憑借對GSH寬動態(tài)范圍的比率熒光響應，該探針能夠用于單個細胞中GSH水平的共聚焦成像和基于流式細胞術的高通量定量分析。這項研究的不足之處在于：羧基的引入雖然提升了探針的水溶性，但也在一定程度上減緩了探針與GSH的反應速率。未來還應尋找更為合適的具有水溶性的陽離子基團以替代羧基。

圖17 谷胱甘肽激活的生物探針Fig.17 GSH-activated biological probe

圖18 基于Michael加成反應的GSH可逆熒光探針Fig.18 Reversible fluorescence probe for GSH based on Michael addition reaction

Guo等［48］首次報道了一種用于GSH檢測的二級比率熒光響應探針，如圖19所示。利用表面活性劑 CTAB（cetyltrimethylammonium bromide）增強GSH與熒光探針的親核取代反應，探針的3位和5位氯得以被GSH的巰基所取代。由于硫醚取代基能夠促進BODIPY類染料的光譜發(fā)生紅移，故單、雙取代產(chǎn)物具有不同的熒光發(fā)射波長。憑借良好的特異性，該探針能夠實現(xiàn)GSH的快速檢測，且具有較高的靈敏度。

圖19 用于GSH檢測的二級比率熒光響應探針Fig.19 Two stages ratio metric fluorescent responsive probe for GSH detection

圖20 GSH-PF3探針的結構與同時檢測GSH和ONOO-的機理Fig.20 Structure of GSH-PF3 probe and its mechanism for simultaneous detection of GSH and ONOO-

近年來，用于雙重或多重分析物檢測的熒光探針被廣泛報道。這類探針能夠實現(xiàn)分子邏輯門的構建以及更為精準的醫(yī)學診斷。James等報道了一種同時檢測過氧亞硝酸根（peroxynitrite，ONOO-）與 GSH的新型“AND”邏輯熒光探針GSH-PF3［49］，如圖 20所示。該探針單獨與 GSH 或ONOO-作用時，熒光響應均十分微弱，當體系中同時存在GSH與ONOO-兩種分析物時，其熒光強度有了顯著的增強。該探針具有良好的選擇性，能夠監(jiān)測代謝產(chǎn)物GSH與ONOO-的共存。這一工作為開發(fā)其它的用于醫(yī)學診斷的“AND”邏輯熒光探針提供了基礎。

6 結 語

近年來，反應型小分子熒光探針這一領域迅速發(fā)展，研究者們可以根據(jù)不同的化學反應機理來設計各種不同結構的選擇性探針。但是，一些問題也是普遍存在的，比如探針的水溶性、穿膜性能、細胞毒性、在細胞或器官中的保留和清除能力以及大動物熒光成像等。為了解決這些問題，設計出應用前景好的熒光探針，科研工作者需要不斷地嘗試，并將計算機模擬、化學反應機理與生物醫(yī)學進行緊密的結合。同時，隨著熒光分析儀器的不斷發(fā)展進步，熒光成像已經(jīng)可以達到細胞器級別。利用熒光探針對未知的生理變化進行實時成像，能夠更加清晰地揭示疾病的變化過程。

反應型熒光探針的不足之處：1）大部分這類探針受限于反應機制，難以實現(xiàn)可逆檢測；2）這類探針的安全性研究多是關于探針在某細胞中的細胞毒性，極少研究其在活體動物內的代謝過程和其他影響；3）這類探針雖然普遍體外穩(wěn)定性良好，但許多探針的生物穩(wěn)定性仍有待研究，如：探針是否會與特定蛋白發(fā)生特異性結合而失去檢測效力；4）部分探針受限于反應機制，靈敏度不高；5）目前所報道的反應型探針大部分都需要紫外或可見光激發(fā)，這有可能導致較高的背景熒光干擾，同時容易造成光損傷，從而限制其在生物系統(tǒng)中的進一步應用。

開發(fā)性能優(yōu)良的反應型小分子熒光探針一定會成為新的研究熱點，致力于研究各類標志物的實時含量及其對生理、病理的影響、作用機制和分布等。這對疾病診療、藥效評價、環(huán)境治理等領域的發(fā)展都具有重要的意義。未來，相關研究趨勢可能涉及以下幾個方面：

1）在疾病監(jiān)測領域，設計診療、預防結合的新型探針。治療型探針可通過釋放藥物或刺激局部產(chǎn)生殺傷腫瘤細胞的活性氧實現(xiàn)治療；

2）與納米材料結合，實現(xiàn)靶向遞送；該類探針也可應用到活體蛋白質標記成像中。

今后探針研究發(fā)展的主要方向應該兼具以下特點：發(fā)射在（近）紅外區(qū)域、水溶性好、高靈敏度、高選擇性、高穩(wěn)定性、響應迅速、低毒性并且活體內可降解?？傊诂F(xiàn)有發(fā)展基礎上，研究者還應探索新型熒光母核和識別基團，探索性質更優(yōu)異的反應型小分子熒光探針。