烏宇亮 張衛(wèi)萍 范力宏 王亭忠 陳 濤 白曉君

(西安交通大學第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，陜西省西安市 710061，電子郵箱：13636810941@163.com)

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(coronary atherosclerotic heart disease,CAD)是冠狀動脈發(fā)生粥樣硬化病變引起血管腔狹窄或阻塞而導致的心臟疾病[1]。CAD的發(fā)病基礎是冠狀動脈的粥樣硬化病變，是由內(nèi)皮損傷、脂質(zhì)代謝異常、免疫紊亂等多重因素引起的冠狀動脈處發(fā)生的慢性代償性炎癥反應，涉及血管內(nèi)膜的脂質(zhì)浸潤、血管內(nèi)皮細胞受損、單核細胞黏附侵襲、平滑肌細胞增生和膠原過度積累等[2]。內(nèi)皮細胞炎癥損傷和平滑肌細胞增生是動脈粥樣硬化形成的關鍵環(huán)節(jié)，也是預防和治療動脈粥樣硬化的重要靶點[3]。胰島素樣生長因子2(insulin-like growth factor 2，IGF2)及其結合蛋白參與內(nèi)皮細胞炎癥損傷和平滑肌細胞增生[4]。高通量測序及生物信息學分析表明長鏈基因間非編碼RNA 01184(long intergenic non-coding RNA 01184,LINC01184)可能參與IGF2通路的調(diào)節(jié)，從而影響內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞的功能。本文探討冠心病患者血清LINC01184的表達水平及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年7月至2016年9月西安交通大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科收治的232例接受診斷性冠狀動脈造影檢查的患者作為研究對象。排除標準：重度糖尿病、心肌梗死患者。根據(jù)冠狀動脈造影結果將患者分為CAD組145例和對照組87例，其中CAD組冠狀動脈有1支以上狹窄≥75%，男性86例，女性59例，年齡(58.2±14.8)歲；對照組冠狀動脈狹窄≤25%，男性42例，女性45例，年齡(57.1±15.1)歲。兩組患者一般資料比較差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，具有可比性，見表1。本研究經(jīng)西安交通大學醫(yī)學院倫理委員會批準，所有患者均被事先告知詳情，并簽署知情同意書。

表1 兩組患者一般資料比較

1.2 儀器與試劑 SuperScriptⅡ逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Invitrogen公司，批號：16064014)；SYBR Green實時定量檢測試劑盒(日本TaKaRa公司，批號：RR820A)；IGF2酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司，ml022801)；白細胞介素6(interleukin 6，IL-6)ELISA試劑盒(碧云天生物技術有限公司，批號：PT158)；腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)ELISA試劑盒(碧云天生物技術有限公司，批號：P1330)；Bio-Rad IQ5型實時定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)；iMarkTM型酶標儀(美國Bio-Rad公司)。

1.3 標本采集 采集研究對象空腹外周血6 mL于含有抗凝劑的采血管中，4℃冷藏30 min，3 000 r/min離心15 min，收取上層血清，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 血清總RNA的提取 血清于冰上融化，每250 μL血清加入750 μL TRIzol，混勻，靜置5 min；加入1/4體積的氯仿(250 μL)，蓋緊管蓋，劇烈搖晃混勻，靜置10 min；4℃下12 000 r/min離心10 min，小心吸取上清，轉(zhuǎn)移至無RNA酶的離心管中，加入等體積的異丙醇，搖晃混勻，室溫靜置10 min；4℃下12 000 r/min離心10 min，棄上清，加1 mL 75%乙醇溶液(無RNA酶)；4℃下12 000 r/min離心10 min，棄乙醇，吸干剩余液體(避免觸及沉淀)，超凈工作臺晾干，用20 μL無RNA酶的ddH2O溶解沉淀，核酸定量儀測定RNA的濃度和純度。

1.5 實時定量PCR檢測LINC01184的表達水平 運用SuperScriptⅡ逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用實時定量PCR檢測LINC01184相對表達量，試劑為SYBR Green實時定量檢測試劑盒。反轉(zhuǎn)錄的反應體系為20 μL，包括總RNA 1 μL，引物1 μL，5×反應緩沖液 4 μL，20 U/μL RNA酶抑制劑1 μL，10 mM dNTP混合物2 μL，逆轉(zhuǎn)錄酶(200 U/μL)1 μL，加ddH2O至20 μL。渦旋混勻，42℃反應60 min，70℃加熱5 min結束反應，獲得cDNA。取適量cDNA模板、0.4 μmol/L上下游引物，在Bio-Rad IQ5型熒光定量PCR中進行反應。PCR反應條件：94℃預變性3 min；94℃ 20 s，55～60℃ 20 s，72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。實驗重復3次，每個樣本設3個副孔。以3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)為內(nèi)參基因。LINC01184引物序列為上游：5′-GCG GTC TTC TCT GTC TTC TTT-3′，下游：5′-CTC CTG TTC GTG TCA GCA ATA-3′；GAPDH引物序列：上游：5′-CTC AGA CAC CAT GGG GAA GGT GA-3′，下游：5′-ATG ATC TTG AGG CTG TTG TCA TA-3′。以2-△△Ct計算LINC01184的相對表達量。

1.6 血清IGF2、IL-6，TNF-α水平檢測 采用ELISA檢測血清IGF2、IL-6和TNF-α的水平，按試劑盒所附說明書進行操作。

1.7 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以(x±s)表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)(百分比)表示，組間比較采用χ2檢驗；相關性分析采用Pearson相關分析法。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 兩組患者血清LINC01184相對表達水平 對照組血清LINC01184相對表達水平為(1.00±0.38)，CAD組為(4.50±1.81)，CAD組血清LINC01184相對表達水平高于對照組(t=3.681,P=0.007)。

2.2 兩組研究對象血清IGF2、IL-6和TNF-α水平比較 CAD組血清IGF2、IL-6和TNF-α水平分別為(133.2±14.1)ng/mL、(147.3±16.3)ng/mL和(154.6±15.7)ng/mL，對照組分別為(20.5±4.2)ng/mL、(18.2±3.3)ng/mL和(15.5±2.6)ng/mL，CAD組血清IGF2、IL-6和TNF-α水平均高于對照組(t=4.598、4.659、5.542，均P<0.001)。

2.3 CAD組患者血清IGF2、IL-6和TNF-α水平與LINC01184相對表達水平的相關性 相關性分析結果顯示，CDA組患者血清LINC01184相對表達水平與IGF2、IL- 6及TNF- α水平均呈正相關(r=0.902， 0.823，0.756，均P<0.001)。見圖1。

圖1 CAD患者血清IGF2、IL-6和TNF-α水平與LINC01184相對表達水平相關性分析

3 討 論

研究表明，遺傳變異是心血管疾病發(fā)生的重要原因，40%的冠心病是遺傳因素造成的[5]。人類基因組的基因只有10%編碼為蛋白質(zhì)，而有85%以上轉(zhuǎn)錄為非編碼RNA，考慮可變剪接的情況下，非編碼RNA數(shù)目可能是蛋白編碼基因的數(shù)倍乃至數(shù)十倍[6]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, LncRNA)可在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平以及翻譯后水平調(diào)控基因表達，其作用機制復雜，是發(fā)掘人類疾病、診斷及評估預后的標志物和治療靶點的分子庫[7]。

CAD的早期診斷對其治療效果有重要影響，但CAD早期癥狀不明顯，甚至無癥狀，早期診斷非常困難，易造成漏診而耽誤最佳治療時機。雖然冠狀動脈造影、冠脈CT血管成像檢查可明確冠狀動脈硬化和狹窄程度，但這些檢測手段存在價格昂貴、創(chuàng)傷性以及放射線輻射等不足，臨床上難以普及。因此，如何找到價格低廉、無創(chuàng)傷且無輻射的早期診斷標志物，成為CAD診治研究的熱點[8]。隨著基因組學及蛋白組學的發(fā)展，循環(huán)LncRNA檢測在心臟病早期診斷中的潛在價值逐漸顯現(xiàn)，且其檢測無創(chuàng)傷、無輻射、費用低廉，易于臨床的推廣和普及[9]。有研究證實循環(huán)中LncRNA H19和LIPCAR水平升高會增加冠心病發(fā)生風險[10-11]。本研究結果也顯示CAD組患者血清LINC01184相對表達水平高于對照組(P<0.05)，提示LINC01184可能成為冠心病早期診斷和治療的靶標。

炎癥是CAD乃至幾乎所有心血管疾病發(fā)生發(fā)展的重要推動因素，貫穿CAD發(fā)生發(fā)展的整個過程。LncRNA作為炎癥反應的潛在關鍵調(diào)節(jié)因子，參與炎癥因子基因表達的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[12]。LncRNA可能作為一種轉(zhuǎn)錄增強子或轉(zhuǎn)錄抑制因子，或作為支架的分子通過與染色質(zhì)重塑復合物RNA結合蛋白的相互作用，或者通過競爭性結合某些特異的miRNA起到調(diào)節(jié)炎癥因子基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯的作用[13]。研究發(fā)現(xiàn)，LINC01184在多種炎癥相關疾病中異常表達，如阿爾茨海默病、心血管疾病、自身免疫性疾病及代謝綜合征等，而在這些疾病中LINC01184可能調(diào)節(jié)IGF2、表皮生長因子受體等多個信號通路[14]。IGF2通過結合其受體或結合蛋白而調(diào)節(jié)細胞增殖、遷移、存活。IGF2與心血管疾病的發(fā)展有關，研究證實IGF2基因參與代謝綜合征、2型糖尿病以及CAD的發(fā)生發(fā)展[15]。研究發(fā)現(xiàn)，IGF2過表達可以導致心肌結構重塑，包括心肌肥厚、左心室增大、心律失常和低血壓[16]。IL-6和TNF-α是兩種經(jīng)典的促炎癥因子，與CAD的發(fā)生發(fā)展密切相關[17]。本研究結果顯示，CAD組患者血清IGF2、IL-6和TNF-α水平均高于對照組，且血清LINC01184表達水平與IGF2、IL-6和TNF-α水平均呈正相關(均P<0.05)，提示LINC01184可能參與CAD病理過程中炎性反應和心肌重塑過程，但其分子機制仍需進一步研究。

綜上所述，CAD患者血清LINC01184水平升高，LINC01184或可作為CAD診斷和評估預后的潛在血清標志物，但其影響CAD發(fā)展的具體作用機制仍有待進一步深入研究。