趙文輝

(青海大學(xué)附屬醫(yī)院病理科，青海省西寧市 810000，電子郵箱：zhaowenhui1978@163.com)

甲狀腺癌是頭頸部和內(nèi)分泌系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，其已成為女性第五大惡性腫瘤病，也是我國(guó)30歲以下女性中最常見的惡性腫瘤[1-2]。甲狀腺癌的發(fā)生與性別、環(huán)境及遺傳因素有關(guān)，通過(guò)早期診斷采用根治手術(shù)結(jié)合促甲狀腺激素抑制與放射治療，可提高患者生存率，但不同分型的甲狀腺癌治療敏感度具有較大差異，部分對(duì)放化療均不敏感者的死亡率仍較高[3]。因此，研究與甲狀腺癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移相關(guān)的標(biāo)記物已成為研究的熱點(diǎn)。骨橋蛋白(osteopontin，OPN)是一種磷酸糖蛋白，有研究表明其與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移及臨床預(yù)后密切相關(guān)[4]。E-鈣黏蛋白是Ca2+依賴性細(xì)胞黏附因子，主要介導(dǎo)細(xì)胞間黏附及維持細(xì)胞骨架，其表達(dá)缺失或異常將引起細(xì)胞離散，與上皮組織惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[5]。β-連環(huán)蛋白是細(xì)胞黏附分子與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，可參細(xì)胞增殖、分化與凋亡。本研究探討甲狀腺癌中OPN、E-鈣黏蛋白及β-連環(huán)蛋白的表達(dá)水平及其與預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2012年5月至2017年6月本院收治的甲狀腺癌患者58例，取其病理確診的甲狀腺癌組織及癌旁>2 cm處正常甲狀腺組織作為對(duì)照，所有患者術(shù)前均未進(jìn)行放療、化療。其中男16例，女42例；>45歲25例，≤45歲33例；病理分型：乳頭狀癌33例，濾泡癌14例，髓樣癌6例，未分化癌5例；分化程度：低分化31例，中分化17例，高分化10例；腫瘤分期：Ⅰ期15例，Ⅱ期21例，Ⅲ期12例，Ⅳ期10例；有包膜浸潤(rùn)40例，無(wú)包膜浸潤(rùn)18例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移23例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移35例。所取甲狀腺癌組織及癌旁正常甲狀腺組織均做石蠟包埋。

1.2 檢測(cè)方法 免疫組化(S-P法)：將組織蠟塊切片(4 μm)后，放入60℃溫箱烤片1 h，以防止脫片；經(jīng)脫蠟、水洗后加入3% H2O2，室溫孵育10 min，然后用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)沖洗3遍；將切片放入1.0%的枸櫞酸緩沖液(pH=6.0)沸水中持續(xù)煮沸2 min后取出，自然冷卻，PBS沖洗3遍，除去切片上多余的PBS；加入山羊血清37℃孵育15 min，傾去不洗；加一抗[OPN鼠抗人單克隆抗體(批號(hào)：ZM-0174)、E-鈣黏蛋白鼠抗人單克隆抗體(批號(hào)：ZM-0092)(即用型)、β-連環(huán)蛋白鼠抗人單克隆抗體(批號(hào)：ZM0422)(即用型)]，37℃孵育60 min(陰性對(duì)照PBS代替一抗)，一抗均購(gòu)置北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；滴加二抗，37℃孵育30 min；滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37℃孵育15 min，PBS沖洗3遍，除去切片上多余的PBS；滴加新鮮配制的3，3′-二氨基聯(lián)苯胺(3，3′-diaminobenzidine，DAB)溶液顯色(DAB顯色試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，批號(hào)：81215710)，用已知陽(yáng)性組織切片作陽(yáng)性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判定 每份組織切片均任意選10個(gè)高倍視野，每個(gè)視野分別計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，共計(jì)1 000個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分率。OPN陽(yáng)性表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞質(zhì)呈棕黃或棕褐色為陽(yáng)性細(xì)胞，陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞數(shù)<10% 為陰性(-)，≥10%為陽(yáng)性(+)。E-鈣黏蛋白陽(yáng)性表達(dá)主要定位于細(xì)胞膜，細(xì)胞膜出現(xiàn)黃棕色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞，無(wú)色為陰性細(xì)胞，單純細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)陽(yáng)性亦為陰性細(xì)胞。參照Gofuku等[6]的方法，E-鈣黏蛋白細(xì)胞膜陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)>70%為陽(yáng)性表達(dá)(+)，≤70%為表達(dá)缺失即陰性表達(dá)(-)。β-連環(huán)蛋白陽(yáng)性主要在細(xì)胞膜表達(dá)，參照Maruyama等[7]的方法判斷，β-連環(huán)蛋白胞膜陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)>70%為陽(yáng)性表達(dá)(+)，≤70%為表達(dá)缺失即陰性表達(dá)(-)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分比表示，比較采用χ2檢驗(yàn)；分類變量的相關(guān)性采用關(guān)聯(lián)性分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 OPN、E-鈣黏蛋白、β-連環(huán)蛋白在甲狀腺癌組織及正常甲狀腺組織中的表達(dá)情況 OPN在甲狀腺癌組織樣本中陽(yáng)性表達(dá)率為79.31%，在正常甲狀腺組織中陽(yáng)性表達(dá)率為15.52%，甲狀腺癌組織中OPN陽(yáng)性表達(dá)率高于正常甲狀腺組織(P<0.05)；E-鈣黏蛋白在甲狀腺癌組織樣本中陽(yáng)性表達(dá)率為34.48%，在正常甲狀腺組織中陽(yáng)性表達(dá)率為87.93%，甲狀腺癌組織中E-鈣黏蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率低于正常甲狀腺組織(P<0.05)；β-連環(huán)蛋白在甲狀腺癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為74.14%，在正常甲狀腺組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為6.90%，甲狀腺癌組織中β-連環(huán)蛋白陽(yáng)性表達(dá)率高于正常甲狀腺組織(P<0.05)。見表1。

表1 OPN、E-鈣黏蛋白和β-連環(huán)蛋白在甲狀腺癌組織及正常甲狀腺組織中的表達(dá)[n(%)]

2.2 OPN、E-鈣黏蛋白、β-連環(huán)蛋白在甲狀腺癌組織中的表達(dá)情況與臨床病理參數(shù)的關(guān)聯(lián)性分析 OPN在甲狀腺癌組織中的表達(dá)與性別、年齡均無(wú)關(guān)(均P>0.05)，但與病理分型、分化程度、腫瘤分期、包膜浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均相關(guān)(均P<0.05)，見表2。E-鈣黏蛋白及β-連環(huán)蛋白的表達(dá)與性別、年齡、病理分型、分化程度、腫瘤分期均無(wú)關(guān)(均P>0.05)，但與包膜浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均相關(guān)(均P<0.05)，見表3～4。

表2 OPN在甲狀腺癌組織中的表達(dá)情況與臨床病理參數(shù)的關(guān)聯(lián)性分析[n(%)]

表3 E-鈣黏蛋白在甲狀腺癌組織中的表達(dá)情況與臨床病理參數(shù)的關(guān)聯(lián)性分析[n(%)]

續(xù)表3

表4 β-連環(huán)蛋白在甲狀腺癌組織中的表達(dá)情況與臨床病理參數(shù)的關(guān)聯(lián)性分析[n(%)]

2.3 甲狀腺癌組織中OPN、E-鈣黏蛋白及β-連環(huán)蛋白表達(dá)之間的相關(guān)性分析 甲狀腺癌組織中OPN表達(dá)與E-鈣黏蛋白表達(dá)具有相關(guān)性(χ2=0.412，P<0.001)；而OPN表達(dá)與β-連環(huán)蛋白表達(dá)則無(wú)相關(guān)性(χ2=0.061，P=0.510)；甲狀腺癌組織中的E-鈣黏蛋白表達(dá)與β-連環(huán)蛋白表達(dá)具有相關(guān)性(χ2=0.370，P<0.001)。

2.4 OPN、E-鈣黏蛋白、β-連環(huán)蛋白表達(dá)與甲狀腺癌預(yù)后的關(guān)系 OPN陽(yáng)性表達(dá)患者的5年生存率為81.03%，低于陰性表達(dá)患者的94.83%(χ2=3.980，P=0.046)；E-鈣黏蛋白陽(yáng)性表達(dá)患者5年生存率為93.10%，陰性表達(dá)患者生存率為89.66%，兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.109，P=0.741)；β-連環(huán)蛋白陽(yáng)性表達(dá)患者的5年生存率為87.93%，陰性表達(dá)患者生存率為91.38%，兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.093，P=0.760)。

3 討 論

甲狀腺癌是臨床上發(fā)病率較高的惡性腫瘤之一，可發(fā)生于任何年齡段人群，但高發(fā)于中青年女性。甲狀腺癌臨床癥狀不明顯，大部分患者缺少典型的惡性表現(xiàn)，多數(shù)患者通過(guò)常規(guī)體檢以及病灶轉(zhuǎn)移后發(fā)現(xiàn)。甲狀腺癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程與多種分子機(jī)制相關(guān)，通過(guò)對(duì)這些相關(guān)分子機(jī)制的研究可為甲狀腺癌的早期診斷提供潛在的分子標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)，有助于惡性程度高及預(yù)后性差患者的早期治療。

OPN是分泌型鈣結(jié)合磷酸化糖蛋白，是細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的重要介導(dǎo)者，含有特異性精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列。OPN在正常細(xì)胞中呈缺乏或低表達(dá)狀態(tài)，而在多數(shù)惡性腫瘤中呈高表達(dá)。OPN與整合蛋白αVβ3及黏附分子CD44受體結(jié)合，改變細(xì)胞行為，介導(dǎo)細(xì)胞黏附、遷移、浸潤(rùn)以及誘導(dǎo)腫瘤新生血管形成、促進(jìn)惡性腫瘤的發(fā)展與轉(zhuǎn)移[8]。周行等[9]研究顯示，OPN在宮頸鱗癌中呈陽(yáng)性表達(dá)，其陽(yáng)性表達(dá)率與組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后不良有關(guān)，陽(yáng)性表達(dá)患者總生存率低于陰性表達(dá)患者。本研究結(jié)果顯示，OPN在甲狀腺癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率高于正常甲狀腺組織，且與病理分型、分化程度、腫瘤分期、包膜浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(均P<0.05)，提示OPN高表達(dá)與甲狀腺癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究結(jié)果還顯示，甲狀腺癌組織中OPN與E-鈣黏蛋白具有相關(guān)性(P<0.05)，而與β-連環(huán)蛋白無(wú)相關(guān)性(P>0.05)；OPN陽(yáng)性表達(dá)患者5年生存率低于陰性表達(dá)患者(P<0.05)，提示OPN陽(yáng)性與甲狀腺癌預(yù)后不良有關(guān)。黃卓雅等[10]研究表明OPN在甲狀腺癌中呈高表達(dá)，與病理分期、分化程度、腫瘤分期、包膜浸潤(rùn)以及頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，與本研究結(jié)果相似。

E-鈣黏蛋白是常見的細(xì)胞表面上皮標(biāo)記物之一，具有較強(qiáng)的細(xì)胞間黏附力，在維持細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和結(jié)構(gòu)的完整性及黏附能力中發(fā)揮重要作用。E-鈣黏蛋白在正常細(xì)胞中呈高表達(dá)，而在結(jié)直腸癌、乳腺癌、乳頭狀甲狀腺癌等惡性腫瘤中呈低表達(dá)。有研究顯示E-鈣黏蛋白表達(dá)降低與結(jié)直腸癌分化、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移以及不良預(yù)后有關(guān)[11]，其能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移，進(jìn)而促進(jìn)乳腺癌發(fā)展[12]。還有研究認(rèn)為E-鈣黏蛋白低表達(dá)與甲狀腺乳頭狀癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)[13]。本研究結(jié)果顯示，E-鈣黏蛋白在甲狀腺癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率低于正常甲狀腺組織，且E-鈣黏蛋白表達(dá)情況與包膜浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(均P<0.05)。這提示E-鈣黏蛋白表達(dá)降低與甲狀腺癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移有關(guān)。

β-連環(huán)蛋白是多功能蛋白質(zhì)，是連環(huán)蛋白家族成員之一，其能夠介導(dǎo)細(xì)胞間黏附，維持上皮細(xì)胞完整性與極性。β-連環(huán)蛋白能與E-鈣黏蛋白胞質(zhì)內(nèi)側(cè)結(jié)合，形成E-鈣黏蛋白/β-連環(huán)蛋白細(xì)胞黏附復(fù)合體，介導(dǎo)兩者之間的細(xì)胞相互作用，維持細(xì)胞間黏附與運(yùn)動(dòng)，進(jìn)而促進(jìn)組織結(jié)構(gòu)及形態(tài)的發(fā)生。有研究表明[14]，β-連環(huán)蛋白在肝細(xì)胞癌中高表達(dá)能夠促進(jìn)癌細(xì)胞增殖，與肝細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移及包膜形成有關(guān)。因此，β-連環(huán)蛋白能夠促進(jìn)正常細(xì)胞間黏附以及腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果顯示，β-連環(huán)蛋白在甲狀腺癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率高于正常甲狀腺組織，且β-連環(huán)蛋白的表達(dá)與包膜浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(均P<0.05)。這提示β-連環(huán)蛋白參與甲狀腺癌的發(fā)展與轉(zhuǎn)移過(guò)程。也有研究表明β-連環(huán)蛋白在甲狀腺癌中呈高表達(dá)，在正常組織中呈低表達(dá)，在漿液性卵巢癌中β-連環(huán)蛋白高表達(dá)與癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移及淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)移有關(guān)[15-16]，與本研究結(jié)果基本一致。

綜上所述，甲狀腺癌中OPN和β-連環(huán)蛋白的表達(dá)上調(diào)而E-鈣黏蛋白的表達(dá)下調(diào)。OPN、E-鈣黏蛋白、β-連環(huán)蛋白的表達(dá)情況與甲狀腺癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后不良有關(guān)，可作為甲狀腺癌早期診斷及預(yù)后不良的標(biāo)記物。