楊子林 陳 鍵

(1 南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南省衡陽(yáng)市 421000，電子郵箱：874987901@qq.com；2 湖南省人民醫(yī)院暨湖南師范大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，長(zhǎng)沙市 410016)

老年呼吸疾病患者由于抵抗力低下以及基礎(chǔ)疾病較重，機(jī)體防御感染的能力低下，是院內(nèi)感染嗜麥芽窄食單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia，SMA)的易感人群[1]。SMA屬于革蘭陰性非發(fā)酵細(xì)菌，廣泛存在于自然界和醫(yī)院環(huán)境中。近年來(lái)，SMA逐漸成為醫(yī)院重要的條件致病菌，呼吸疾病住院患者的SMA感染率不斷增高[2]。SMA的耐藥基因盒可通過(guò)整合子介導(dǎo)插入轉(zhuǎn)座子或接合質(zhì)粒，并在質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子和染色體之間移動(dòng)，可導(dǎo)致耐藥基因盒的水平增高，增加了臨床治療難度[3]。目前有關(guān)SMA的Ⅰ類(lèi)整合子基因與獲得性耐藥的系統(tǒng)研究不多。本研究分析老年呼吸疾病住院患者SMA感染及耐藥情況，并對(duì)SMA攜帶的Ⅰ類(lèi)整合酶相關(guān)基因進(jìn)行檢測(cè)，以期為臨床SMA感染的治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2013年1月至2017年12月間在湖南省人民醫(yī)院住院的老年呼吸疾病患者共3 719例，其中有402例感染SMA。402例患者中，男257例，女145例，年齡65～92(68.1±8.2)歲；肺部感染患者187例，慢性阻塞性肺疾病急性加重期患者143例，支氣管擴(kuò)張并感染患者72例。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)臨床確診為醫(yī)院獲得性肺炎(包括呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎)、慢性阻塞性肺疾病急性發(fā)作、支氣管擴(kuò)張癥并感染等常見(jiàn)呼吸系統(tǒng)疾病；患者白細(xì)胞計(jì)數(shù)或中性粒細(xì)胞分類(lèi)增高，胸部影像學(xué)提示肺部感染；按照第4版《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》[4]中的要求，經(jīng)痰涂片、痰培養(yǎng)分離到SMA。所有患者均簽署知情同意書(shū)，本研究通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)同意。

1.2 研究方法

1.2.1 SMA藥敏試驗(yàn)：采用長(zhǎng)沙天地人生物科技有限公司TDR-300型微生物全自動(dòng)鑒定系統(tǒng)，參照2017年美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)推薦的方法和判斷標(biāo)準(zhǔn)[5]，檢測(cè)402株嗜麥芽窄食單胞菌對(duì)頭孢他啶、替卡西林/克拉維酸、頭孢哌酮/舒巴坦、米諾環(huán)素、左氧氟沙星、替加環(huán)素、復(fù)方新諾明、氯霉素的最低抑菌濃度，并判斷其是否對(duì)相應(yīng)藥物產(chǎn)生耐藥。

1.2.2 SMA DNA模板制備：研究對(duì)象中痰標(biāo)本的采集嚴(yán)格按照診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]：細(xì)菌濃度≥107 cfu/ml或連續(xù)兩次細(xì)菌濃度105 cfu/ml～106 cfu/ml則視為病原菌，同時(shí)白細(xì)胞計(jì)數(shù)增高或中性粒細(xì)胞分類(lèi)增高及胸部CT顯示肺部感染。細(xì)菌質(zhì)量控制菌株為大腸桿菌、銅綠假單胞菌，均購(gòu)自原衛(wèi)生部臨床實(shí)驗(yàn)室中心(批號(hào)：ATCC25922、ATCC27853)。將待測(cè)菌在血平板上培養(yǎng)18～24 h后，取8個(gè)菌落置于200 μl滅菌雙蒸水中研磨制成新鮮菌懸液；95℃煮沸10 min，-20℃放置5 min，13 000 r/min離心10 min，取上清液作為DNA模板提取物。

1.2.3 整合酶、耐藥基因的檢測(cè)：檢測(cè)的整合酶、耐藥基因包括Ⅰ類(lèi)整合子1類(lèi)整合酶(class Ⅰ integron class 1 integrase，IntⅠ1)、Ⅰ類(lèi)整合子2類(lèi)整合酶(class Ⅰ integron class 2 integrase，IntⅠ2)、Ⅰ類(lèi)整合子3類(lèi)整合酶(class Ⅰ integron class 3 integrase，Int Ⅰ 3)、消毒劑-磺胺類(lèi)耐藥基因1(qacEΔ1-Sul 1)、磺胺類(lèi)耐藥基因2(sulfonamide resistance gene 2，Sul 2)、甲氧芐啶耐藥基因dfrA12。所有基因引物序列均由北京三博遠(yuǎn)志生物公司合成，見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)體系：上下游引物各1 μl，DNA模板2 μl，Taq DNA聚合酶0.2 μl，10×PCR緩沖液(Mg2+)2.5 μl，脫氧核糖核苷三磷酸(2.5 mmol/L)2.0 μl，雙蒸水將體積補(bǔ)至25 μl。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；94℃ 30 s、50℃ 40 s、72℃ 40 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。采用LifeECO基因擴(kuò)增儀(杭州博日有限公司)進(jìn)行擴(kuò)增基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證是否擴(kuò)增成功。

表1 PCR擴(kuò)增引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)(百分比)表示，采用線(xiàn)性趨勢(shì)檢驗(yàn)分析不同年份間感染率和耐藥率的變化趨勢(shì)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同年份老年呼吸疾病患者SMA的感染率 2013～2017年老年呼吸疾病患者SMA總感染率為10.8%(402/3 719)，SMA感染率有逐年增加的趨勢(shì)(P<0.05)，見(jiàn)表2。

2.2 不同年份SMA對(duì)不同抗生素的耐藥性 共檢出236例SMA耐藥菌株、166例SMA非耐藥菌株。不同年份中，SMA對(duì)氯霉素的耐藥率均最高，其次為頭孢他啶和替卡西林/克拉維酸；SMA對(duì)頭孢哌酮/舒巴坦、米諾環(huán)素、復(fù)方新諾明和替加環(huán)素的耐藥率均低于30%。SMA對(duì)頭孢他啶、替卡西林/克拉維酸、米諾環(huán)素、復(fù)方新諾明、替加環(huán)素和左氧氟沙星的耐藥率均有逐年增加的趨勢(shì)(均P<0.05)。見(jiàn)表3。

表2 2013～2017年老年呼吸疾病患者的SMA感染率[n(%)]

表3 2013～2017年SMA對(duì)8種抗生素的耐藥情況[n(%)]

2.3 不同年份SMA耐藥基因檢測(cè)情況 402株SMA中，有204株Int Ⅰ 1基因陽(yáng)性，陽(yáng)性率為50.7%；未檢出Int Ⅰ 2和Int Ⅰ 3基因陽(yáng)性菌株。在236例耐藥菌株中Int Ⅰ 1基因陽(yáng)性率為67.4%(159/236)，166例非耐藥菌株中Int Ⅰ 1基因陽(yáng)性率為27.1%(45/166)，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=63.211，P<0.001)。趨勢(shì)性檢驗(yàn)結(jié)果顯示，SMA的qacEΔ1-Sul 1、IntⅠ1、dfrA12基因陽(yáng)性率有逐年上升的趨勢(shì)(P<0.05)，見(jiàn)表4。在對(duì)復(fù)方新諾明耐藥的53株SMA中共29株qacE△1-sul 1合并Int Ⅰ 1基因陽(yáng)性，6株qacE△1-Sul 1、Sul 2、IntⅠ1基因均陽(yáng)性，18株僅IntⅠ1基因陽(yáng)性。

表4 2013～2017年SMA耐藥基因檢測(cè)結(jié)果[n(%)]

3 討 論

根據(jù)2016年中國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)的數(shù)據(jù)[7]，在非發(fā)酵細(xì)菌中，SMA的分離率僅次于銅綠假單胞菌和不動(dòng)桿菌。本研究結(jié)果顯示，2013～2017年我院老年呼吸疾病住院患者SMA感染率為10.8%(402/3 719)，高于徐鳴皋等[1]的研究結(jié)果。此外，SMA感染率呈逐年增加的趨勢(shì)(P<0.05)。老年呼吸疾病住院患者各器官功能及免疫功能低下，存在呼吸功能減退或營(yíng)養(yǎng)不良等情況，且長(zhǎng)期住院患者需接受機(jī)械通氣和深靜脈置管等操作，而我院老年住院患者年齡偏大，這均導(dǎo)致近年間SMA感染率逐年上升。因此，在進(jìn)行醫(yī)院感染控制時(shí)，應(yīng)將老年呼吸疾病住院患者作為SMA感染的高危人群進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

2013～2017年，在我院老年呼吸疾病住院患者中檢出的SMA對(duì)頭孢他啶、替卡西林/克拉維酸、復(fù)方新諾明、左氧氟沙星和替加環(huán)素的耐藥率呈逐年上升趨勢(shì)，且對(duì)頭孢他啶、頭孢哌酮/舒巴坦、左氧氟沙星的耐藥率高于國(guó)內(nèi)相關(guān)研究的結(jié)果[8]。這可能是因?yàn)榇蟛糠掷夏旰粑鼉?nèi)科患者的病程較長(zhǎng)，且其所患疾病具有易復(fù)發(fā)的特點(diǎn)；另外，臨床上大量的經(jīng)驗(yàn)性用藥或盲目使用抗生素，導(dǎo)致了SMA耐藥菌株數(shù)量的增加，并造成了SMA對(duì)多種藥物耐藥。這種現(xiàn)象給臨床治療造成巨大困難，而由耐藥菌引起的菌血癥又是導(dǎo)致抗感染治療失敗及死亡的重要原因，因此，必須對(duì)抗生素的使用進(jìn)行規(guī)范化管理。

SMA的耐藥基因突變率高，往往導(dǎo)致體外藥敏試驗(yàn)和臨床治療效果不一致，而這與其整合子系統(tǒng)有關(guān)[9-10]。SMAⅠ類(lèi)整合子系統(tǒng)中的IntⅠ1、IntⅠ2和 IntⅠ3基因分別主要編碼Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類(lèi)整合酶，這些整合酶是捕獲外來(lái)基因并將其轉(zhuǎn)化為功能基因的功能單元。整合子可以位于轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒等可移動(dòng)基因原件上，并可在不同種的細(xì)菌之間進(jìn)行水平轉(zhuǎn)移，這導(dǎo)致了耐藥基因盒的水平增高[11]，并與耐藥基因的傳播密切相關(guān)。大多數(shù)Ⅰ類(lèi)整合子的5′端相似，但3′端具有差異，其5′端有編碼整合酶的IntⅠ基因和啟動(dòng)子，3′端有3個(gè)開(kāi)放讀碼框，即季銨鹽化合物及溴乙啶的耐藥基因(qacEΔ1)、磺胺耐藥基因(Sul)和功能不明的閱讀框。本研究結(jié)果顯示，402株SMA中有204株IntⅠ基因陽(yáng)性菌，陽(yáng)性率為50.7%，高于趙蘇瑛等[12]的研究結(jié)果。趨勢(shì)性檢驗(yàn)結(jié)果顯示，Int Ⅰ 1基因陽(yáng)性率呈逐年上升的趨勢(shì)，且236例SMA耐藥菌株中Int Ⅰ 1基因陽(yáng)性率高于非耐藥菌株(均P<0.05)。另外本研究未發(fā)現(xiàn)IntⅠ2和IntⅠ3陽(yáng)性菌，提示IntⅠ1基因或許是導(dǎo)致老年呼吸疾病住院患者感染的SMA耐藥性增加的原因。本研究中，236例SMA耐藥菌株中有77例的IntⅠ1為陰性，分析其原因可能是由于IntⅠ1基因發(fā)生突變，導(dǎo)致PCR擴(kuò)增失??；也可能是IntⅠ1陰性的SMA耐藥株通過(guò)非IntⅠ1基因機(jī)制引起耐藥，如產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶、氨基糖苷類(lèi)修飾酶、多藥外排泵等。而在166例SMA非耐藥菌株中，有45例IntⅠ1陽(yáng)性，說(shuō)明不是所有的整合子都攜帶耐藥基。由此可見(jiàn)，無(wú)論在SMA耐藥菌株還是在SMA非耐藥菌株中，均存在藥物耐藥性檢測(cè)結(jié)果與基因型耐藥檢測(cè)結(jié)果不一致的情況。因此，繼續(xù)深入研究SMA中的整合子系統(tǒng)與耐藥基因的關(guān)系具有重要意義。

復(fù)方新諾明是磺胺甲噁唑/甲氧芐啶的復(fù)合制劑，是治療SMA感染的首選藥物。本研究共發(fā)現(xiàn)53株SMA對(duì)復(fù)方新諾明耐藥，且其耐藥率呈逐年上升的趨勢(shì)(P<0.05)；目前認(rèn)為SMA對(duì)復(fù)方新諾明的耐藥機(jī)制主要與獲得的二氫葉酸合成酶(編碼基因sul)和Ⅰ類(lèi)整合子攜帶的季銨鹽化合物耐藥基因(編碼基因qac)有關(guān)[13-14]。本研究結(jié)果也顯示，qacE△1-Sul 1合并IntⅠ1陽(yáng)性共29株，qacE△1-Sul 1、Sul 2和IntⅠ1同時(shí)陽(yáng)性6株，僅IntⅠ 1陽(yáng)性有18株。另有學(xué)者指出，SMA對(duì)復(fù)方新諾明的耐藥機(jī)制還與獲得的二氫葉酸還原酶(編碼基因dfrA)有關(guān)[15]。但本研究中，對(duì)復(fù)方新諾明耐藥的SMA均未檢測(cè)到dfrA12陽(yáng)性菌。對(duì)復(fù)方新諾明耐藥的SMA出現(xiàn)IntⅠ1陽(yáng)性而qacE△1-Sul 1陰性以及未檢測(cè)到dfrA12的原因可能是Ⅰ類(lèi)整合子3′保守區(qū)域片段發(fā)生缺失、突變或者被插入序列取代，導(dǎo)致PCR擴(kuò)增失敗。

綜上所述，老年呼吸疾病住院患者SMA的感染率較高，SMA對(duì)抗菌藥物耐藥率、整合酶基因、耐藥基因檢出率逐年增加。因此，臨床上應(yīng)采用細(xì)菌培養(yǎng)的方法來(lái)密切監(jiān)測(cè)SMA的感染情況，重視藥物敏感試驗(yàn)中的耐藥結(jié)果，并尋找新的抗感染方法來(lái)改變細(xì)菌多重耐藥和耐藥基因的演變發(fā)展?fàn)顩r，同時(shí)應(yīng)合理使用抗生素以防止耐藥基因的傳播。