楊 乾 姚宏亮 范 潔 趙 鳴

(1 中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院胃腸外科，湖南省長沙市 410000，電子郵箱：bq9195@csu.edu.cn；2 湖南省湘潭市中心醫(yī)院普外科，湘潭市 411100)

胃癌是我國最為常見的消化道惡性腫瘤，2015年中國胃癌新發(fā)病例約67.9萬例，胃癌死亡病例約49.8萬例[1]。我國的胃癌患者發(fā)現(xiàn)時(shí)多以進(jìn)展期為主，術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是總體預(yù)后差的重要影響因素，其中腹膜轉(zhuǎn)移是胃癌患者最常見的轉(zhuǎn)移方式，約占50%以上，且該病缺乏有效的藥物，治療困難[2]。伴有腹膜轉(zhuǎn)移的胃癌患者，中位生存期僅12個(gè)月左右。在ToGA試驗(yàn)中，人類表皮生長因子受體-2表達(dá)陽性的胃癌患者經(jīng)赫賽汀(曲妥珠單抗)靶向治療后生存期并無明顯延長[3]。目前，臨床尚缺乏有效的靶點(diǎn)藥物用于治療胃癌伴腹膜轉(zhuǎn)移。本文分析胃癌伴腹膜轉(zhuǎn)移患者原發(fā)病灶中14-3-3 zeta的表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系，以及患者預(yù)后的影響因素，為進(jìn)一步尋找胃癌伴腹膜轉(zhuǎn)移患者的分子標(biāo)志物以及治療靶點(diǎn)提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來源 選取2010年1月至2016年12月在湖南省湘潭市中心醫(yī)院就診的76例胃癌伴有腹膜轉(zhuǎn)移患者的胃癌組織所有病例的診斷均通過手術(shù)及病理證實(shí)。

1.2 主要試劑 兔抗人14-3-3 zeta多克隆抗體購自Abcam公司代理長沙維世爾生物科技有限公司(批號(hào)：ab51129)，驢抗兔二抗購自Thermo Fisher Scientific公司(批號(hào)：A-31572)，二氨基聯(lián)苯胺辣根過氧化物酶顯色試劑盒購自碧云天公司(批號(hào)：P0203)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 將所有患者胃癌原發(fā)灶組織的蠟塊進(jìn)行切片，將石蠟切片依次置于二甲苯Ⅰ(靜置10 min)、二甲苯Ⅱ(靜置10 min)、1∶1二甲苯/酒精溶液(靜置10 min)、100%酒精溶液(靜置5 min)、95%酒精溶液(靜置5 min)、75%酒精溶液(靜置5 min)以及50%酒精(靜置5 min)，然后使用磷酸緩沖鹽(phosphate buffered saline，PBS)溶液洗滌3次，3 min/次。將石蠟切片置于乙二胺四乙酸緩沖液15 min修復(fù)抗原。每張切片加入適量的3%過氧化氫后室溫孵育15 min，再次使用PBS溶液洗滌3次，3 min/次。(4)每張切片加適量的脫脂牛奶，孵育15 min，PBS溶液洗滌3次，3 min/次。每張切片加適量一抗，室溫下孵育60 min或4℃過夜。將石蠟切片用PBS溶液沖洗3次，5 min/次。除去PBS溶液，每張切片加二抗，37℃孵育30 min。PBS溶液沖洗3次，3 min/次。每張切片加1滴新鮮配制的二氨基聯(lián)苯胺，留置10 min進(jìn)行顯色。用自來水沖洗石蠟切片，蘇木素復(fù)染(20～30 s)后，再用自來水沖洗，PBS溶液返藍(lán)。切片經(jīng)梯度酒精脫水干燥，中性樹膠封固。

1.4 結(jié)果判定 采用12分法進(jìn)行免疫組化評(píng)分[4]。染色強(qiáng)度評(píng)分：陰性0分；弱1分；中等2分；強(qiáng)陽性3分。陽性細(xì)胞比例評(píng)分：<5%為0分；5%～25%為1分；26%～50%為2分；51%～75%為3分；>75%為4分。免疫組化評(píng)分=染色強(qiáng)度×陽性細(xì)胞比例。采用中分法對(duì)14-3-3 zeta表達(dá)情況進(jìn)行分組，≤7分為14-3-3 zeta低表達(dá)，共49例，≥8分為14-3-3 zeta，共27例。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分比表示，比較采用χ2檢驗(yàn)；生存分析采用Kaplan-Meier法；影響因素分析采用Cox回歸分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 14-3-3 zeta低表達(dá)組和高表達(dá)組的臨床病理特征比較 14-3-3 zeta低表達(dá)組和高表達(dá)組的年齡、性別、Boarrmann Ⅳ型及化療病例比例比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，但兩組的腫瘤位置、行姑息性胃切除術(shù)及印戒細(xì)胞癌者比例、腹水分級(jí)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見表1。

表1 14-3-3 zeta低表達(dá)組和高表達(dá)組的臨床病理特征比較

注：腹水分級(jí)：無為<300 ml；少量為≥300 ml但<500 ml；中量為≥500 ml但≤3 000 ml；大量為>3 000 ml。

2.2 14-3-3 zeta低表達(dá)組和高表達(dá)組的預(yù)后比較 14-3-3 zeta低表達(dá)組的中位生存期為15.33個(gè)月，高于14-3-3 zeta高表達(dá)患者的7.97個(gè)月(χ2=8.025，P=0.005)，見圖1。

2.3 行或未行姑息性胃切除術(shù)以及術(shù)前轉(zhuǎn)化化療患者的預(yù)后比較 行術(shù)前轉(zhuǎn)化化療患者的中位生存期為15.47個(gè)月，高于未行術(shù)前轉(zhuǎn)化化療患者的5.73個(gè)月(χ2=16.775，P<0.001)。行姑息性胃切除術(shù)患者的中位生存期為21.57個(gè)月，高于未行姑息性胃切除術(shù)患者的8.50個(gè)月(χ2=18.806，P<0.001)。見圖2。

圖1 14-3-3 zeta高表達(dá)和低表達(dá)組的生存曲線

圖2 是否行姑息性胃切除術(shù)以及術(shù)前轉(zhuǎn)化化療的生存曲線

2.4 影響胃癌伴腹膜轉(zhuǎn)移患者預(yù)后的多因素回歸分析 以死亡為因變量，以14-3-3 zeta表達(dá)水平(低=0，高=1)、行姑息性胃切除術(shù)(是=0，否=1)以及術(shù)前行轉(zhuǎn)化化療(是=0，否=1)為協(xié)變量，采用Cox回歸模型進(jìn)行多因素分析，結(jié)果顯示，14-3-3 zeta高表達(dá)、未行姑息性胃切除術(shù)、術(shù)前未行轉(zhuǎn)化化療均為胃癌伴有腹膜轉(zhuǎn)移患者死亡的危險(xiǎn)因素(均P<0.05)，見表2。

表2 影響胃癌伴腹膜轉(zhuǎn)移患者預(yù)后的多因素分析

3 討 論

14-3-3蛋白家族可以和許多信號(hào)蛋白結(jié)合，包括激酶、磷酸酶和跨膜受體等，在細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期以及信號(hào)傳導(dǎo)的調(diào)控等方面發(fā)揮重要作用[5]。14-3-3 zeta是14-3-3蛋白家族的重要成員之一，其主要功能是調(diào)控凋亡，可通過不同機(jī)制對(duì)凋亡產(chǎn)生抑制效應(yīng)，如對(duì)B淋巴細(xì)胞瘤-2家族的調(diào)控[6]。研究表明，14-3-3 zeta在肺癌、乳腺癌等惡性腫瘤中均以癌基因的形式存在[7-8]。本研究結(jié)果還顯示，胃癌伴腹膜轉(zhuǎn)移患者中14-3-3 zeta的表達(dá)與腫瘤位置、是否為印戒細(xì)胞癌以及腹水的程度可能有關(guān)(均P<0.05)，在14-3-3 zeta高表達(dá)的胃癌患者中，印戒細(xì)胞癌所占比例較多，而在胃癌患者中，印戒細(xì)胞癌往往被認(rèn)為更容易發(fā)生腹膜轉(zhuǎn)移并產(chǎn)生腹水，腹水則是胃癌患者出現(xiàn)腹脹癥狀的主要原因，且此類患者預(yù)后極差。

既往研究中，14-3-3家族蛋白已被證實(shí)與很多惡性腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)，包括直腸癌、結(jié)腸癌、卵巢癌等[9-11]。然而，目前有關(guān)14-3-3 zeta在胃癌中表達(dá)情況的報(bào)道仍較少。腹膜轉(zhuǎn)移是胃癌最為常見也是治療效果最差的轉(zhuǎn)移方式。至今尚無十分有效的指標(biāo)用于預(yù)測胃癌伴腹膜轉(zhuǎn)移患者的預(yù)后。本研究結(jié)果顯示，14-3-3 zeta高表達(dá)組患者中位生存期更短(P<0.05)，提示此類胃癌伴腹膜轉(zhuǎn)移患者的預(yù)后較差；進(jìn)一步多因素分析結(jié)果顯示，14-3-3 zeta高表達(dá)為胃癌伴腹膜轉(zhuǎn)移患者死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一(P<0.05)。因此，14-3-3 zeta蛋白或可作為胃癌伴腹膜轉(zhuǎn)移患者預(yù)后的有效預(yù)測指標(biāo)。有研究表明姑息性胃切除術(shù)并不能改善胃癌伴腹膜轉(zhuǎn)移患者的預(yù)后[12]。而隨著化療藥物的發(fā)展以及個(gè)體化精準(zhǔn)治療的推進(jìn)，有學(xué)者認(rèn)為姑息性胃切除術(shù)可以改善特定的胃癌伴腹膜轉(zhuǎn)移患者的預(yù)后[13]，但目前臨床上尚無有效的指標(biāo)用于此類人群的篩查?？傊熋舾行院?、腹膜轉(zhuǎn)移較為局限的胃癌患者往往可以通過姑息性胃切除術(shù)獲益。在本研究中，未行姑息性胃切除術(shù)、術(shù)前未行轉(zhuǎn)化化療均為胃癌伴腹膜轉(zhuǎn)移患者死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(均P<0.05)，而14-3-3 zeta高表達(dá)的患者預(yù)后更差，因此對(duì)于14-3-3 zeta低表達(dá)的胃癌患者，可以考慮進(jìn)行更為積極的術(shù)前化療以及手術(shù)干預(yù)。

綜上所述，胃癌伴腹膜轉(zhuǎn)移患者的腫瘤位置、病理類型及腹水程度可能與14-3-3 zeta表達(dá)水平有關(guān)；14-3-3 zeta高表達(dá)、未行姑息性胃切除術(shù)以及術(shù)前未行轉(zhuǎn)化化療的胃癌伴腹膜轉(zhuǎn)移患者預(yù)后更差獨(dú)立危險(xiǎn)因素。14-3-3 zeta或可作為胃癌伴腹膜轉(zhuǎn)移患者預(yù)后的預(yù)測因素，并可為患者的術(shù)前化療及手術(shù)干預(yù)提供參考。但本研究為回顧性研究，存在較多的混雜因素，此外納入病例數(shù)偏少且均來源自同一醫(yī)療中心，因此本研究具有一定的局限性，其結(jié)果仍有待于進(jìn)一步的前瞻性研究證實(shí)。