徐宏智 曾家耀 赫 軍 江現(xiàn)強 夏可義 傅漢琨 陸世鋒 王宇坤 文亦磊 黃恒江 吳 磊

(1 廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生學(xué)院，南寧市 530001，電子郵箱：499242539@qq.com；2 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院胃腸腺體外科，南寧市 530023)

結(jié)直腸癌是消化道常見的惡性腫瘤，在惡性腫瘤中其發(fā)病率位居第三，死亡率位居第四[1]。目前，臨床上采取以手術(shù)為主的綜合方案治療結(jié)直腸癌，但療效十分有限，術(shù)后轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是影響其療效和預(yù)后的主要因素。已有研究證實，惡性腫瘤的新生血管生成是腫瘤生長和復(fù)發(fā)的必要條件[2-3]。惡性腫瘤的血管生成過程涉及多種復(fù)雜機制，有學(xué)者認(rèn)為其與促紅細(xì)胞生成素肝細(xì)胞激酶(erythropoietin-producing hepatocyte kinase，Eph)B4受體及其配體EphrinB2的表達(dá)密切相關(guān)[4-5]?；谶@一理論，本研究通過建立裸鼠結(jié)直腸癌模型，觀察消瘤湯對裸鼠結(jié)直腸移植癌組織中EphrinB2及EphB4蛋白表達(dá)的影響，探討消瘤湯抗腫瘤血管生成的作用，為結(jié)直腸癌的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 無特定病原體級BALB/c裸鼠250只，雄性，體質(zhì)量(20±2)g，購自廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，生產(chǎn)許可證編號:SCXK桂2009-0002。所有裸鼠均在廣西中醫(yī)藥大學(xué)動物飼養(yǎng)中心恒溫恒濕條件下飼養(yǎng)，墊料、飼料和飲水均經(jīng)滅菌處理。

1.2 藥物 消瘤湯組成：黨參15 g、黃芪15 g、薏苡仁20 g、田七6 g、扶芳藤12 g、山慈菇15 g、紫河車6 g、半枝蓮15 g等。濃煎30 mL，生藥含量3.5 g/mL，由廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室，按1995年《中華人民共和國藥典》[6]中有關(guān)成藥煎膏劑制劑標(biāo)準(zhǔn)制備。貝伐單抗注射液購自北京康立特有限公司[規(guī)格：100 mg(4 mL)/瓶；生產(chǎn)批號：15734]。

1.3 主要試劑 二喹啉甲酸蛋白定量試劑盒購自上海碧云天公司(貨號：P0010)；Ponceau S染色液購自美國Sigma公司(貨號：P3504)。一抗：EphB4(兔多抗)購自德國CST公司(貨號：14960s)，EphrinB2(兔多抗)購自英國Abcam公司(貨號：Ab150411)，內(nèi)參β-肌動蛋白(為鼠多抗)購自英國Abcam公司(貨號：ab6276)。

1.4 儀器 小型電泳槽(型號：165-8001)、基礎(chǔ)電泳儀(型號：164-5050)、小型轉(zhuǎn)印槽(型號：170-3930)均購自美國Bio-Rad公司，低溫冷凍離心機(型號：Fresco)購自美國賽默太飛世爾科技公司。

1.5 動物分組及人結(jié)腸癌裸鼠移植瘤動物模型的制備 將200只裸鼠按隨機數(shù)字表法分為對照組、中藥組、單抗組、復(fù)合組，各50只。另取25只裸鼠作為人結(jié)腸腫瘤標(biāo)本移植的培養(yǎng)鼠，腫瘤標(biāo)本移植的方法參照文獻(xiàn)[7-9]。取1例結(jié)腸癌患者的新鮮手術(shù)標(biāo)本，將標(biāo)本切成約1 cm×1 cm×1 cm的小植塊后移植到培養(yǎng)裸鼠右側(cè)肩胛區(qū)背部皮下；移植一段時間后，由于體液免疫作用，B細(xì)胞產(chǎn)生抗體作用于移植處，此時腫瘤體積會縮小；再經(jīng)過一段時間，由于腫瘤的生長、增殖，其體積又會增大，說明腫瘤在裸鼠上成功存活，待腫塊長到約2 cm×2 cm×1 cm時被取下，再分別取小植塊經(jīng)手術(shù)移植到各組所有裸鼠的回盲部結(jié)腸的漿膜層上，方法如下：碘附常規(guī)消毒3遍，作右下腹部切口，依次切開皮膚、皮下組織、肌肉層以及腹膜，沿末端盲腸找到回盲部，切開并分離回盲部結(jié)腸漿膜層，將腫瘤組織包埋縫合固定于結(jié)腸的漿膜層中；止血，逐層縫合腹壁切口。

1.6 干預(yù)方法 移植3 d后，對照組給予蒸餾水灌胃，中藥組給予消瘤湯灌胃，單抗組在裸鼠尾靜脈予靜脈注射貝伐單抗；復(fù)合組給予消瘤湯灌胃聯(lián)合靜脈注射貝伐單抗。參照中藥藥理[10]，消瘤湯灌胃1 mL/次，3次/d，連續(xù)6周。參照《藥理實驗方法學(xué)》[11]及貝伐單抗使用說明書上針對結(jié)直腸癌的使用劑量，給予貝伐單抗5 mg/kg靜脈注射，連續(xù)6周。對照組蒸餾水灌胃1 mL/次，3次/d，連續(xù)6周。給藥6周后，各組所有裸鼠均剖取大腸，用磷酸緩沖鹽溶液洗凈大腸腫瘤組織，濾紙吸干，稱重后，分別予10%甲醛液固定及液氮保存。

1.7 免疫印跡試驗法檢測腫瘤組織中EphB4及EphrinB2蛋白表達(dá) (1)提取總蛋白：根據(jù)試劑盒說明書，采用二喹啉甲酸法提取腫瘤組織的總蛋白，用Bradford方法測定蛋白濃度。(2)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳：根據(jù)目的蛋白的分子量，配制12%分離膠，濃縮膠濃度為5%。將待檢測EphB4及EphrinB2蛋白上樣。電泳條件為濃縮膠恒壓90 V，約20 min；分離膠恒壓160 V，電泳停止時間通過預(yù)染蛋白標(biāo)記確定。(3)轉(zhuǎn)膜：于300 mA恒流，0.45 μm孔徑硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)膜35 min；轉(zhuǎn)膜完成后采用麗春紅染色試劑對膜進(jìn)行染色，觀察轉(zhuǎn)膜效果，同時做好泳道標(biāo)記，準(zhǔn)備預(yù)實驗時按照縱向泳道剪膜；封閉，將膜完全浸沒于3%牛血清白蛋白-TBST中室溫輕搖30 min。(4)免疫反應(yīng)：用3%牛血清白蛋白-TBST稀釋一抗，濃度分別為EphB4 100 μg/mL、EphrinB2 1mg/mL、β-肌動蛋白1 mg/mL，室溫孵育10 min，置于4℃過夜；第2天取出膜，在室溫下孵育30 min；用TBST洗膜5次，3 min/次。二抗孵育，用5%脫脂奶粉-TBST稀釋二抗，即辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔/小鼠IgG(H+L)(1 ∶3 000)，室溫輕搖40 min；用TBST洗膜6次，3 min/次。(5)X射線膠片曝光顯影后行凝膠圖像分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以(x±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

各治療組(中藥組、單抗組、聯(lián)合組)腫瘤組織中的EphrinB2、EphB4蛋白的相對表達(dá)水平均低于對照組，且中藥組和聯(lián)合組的相對表達(dá)水平均低于單抗組(均P<0.05)，而中藥組和聯(lián)合組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1、圖1、圖2、圖3。

表1 各組EphrinB2、EphB4蛋白相對表達(dá)水平比較(x±s，μg/L)

注：與對照組比較，*P<0.05；與中藥組比較，#P<0.05；與單抗組比較，@P<0.05。

圖1 EphrinB2在各組腫瘤組織中的表達(dá)情況 圖2 EphB4在各組腫瘤組織中的表達(dá)情況 圖3 內(nèi)參蛋白在各組腫瘤組織中的表達(dá)情況

3 討 論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及預(yù)后與機體的免疫功能及腫瘤組織血管生成有關(guān)[12]。惡性腫瘤的血管生成涉及各種復(fù)雜的分子機制，其中內(nèi)皮細(xì)胞受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases，RTK)是血管生成不可或缺的調(diào)節(jié)因素。目前已知的RTK包括血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)受體和各種Eph受體等。其中，VEGF被普遍認(rèn)為是最重要也是作用最強大的特異性促血管生成因子。Eph受體是RTK家族中最大的成員，其配體Ephrin大部分都在細(xì)胞表面表達(dá)，Eph受體和配體Ephrin統(tǒng)稱為Eph家族蛋白。Eph家族蛋白包含16種受體和8種配體。由于各配體及受體的同源序列和兩者相結(jié)合的特異性，Eph受體又被分為A(A1～A10)和B(B1～B6)兩大類。目前，針對EphB4受體及其配體EphrinB2與腫瘤血管生成關(guān)系的研究已成為熱點。

惡性腫瘤的生長包括兩個不同的時期，即無血管的緩慢生長期和有血管的快速增殖期。在惡性腫瘤沒有形成新生血管之前，只能生長到1～2 mm3，且不會轉(zhuǎn)移，而在新生血管生成以后，腫瘤呈指數(shù)倍數(shù)增長，轉(zhuǎn)移的概率也隨之增加。由此可見，新生血管的形成是各種惡性腫瘤發(fā)展和轉(zhuǎn)移的前提條件。腫瘤的血管生成方式多種多樣，且其生成過程、機制也極為復(fù)雜，涉及多種分子信號[13-16]，其中EphB4/EphrinB2系統(tǒng)雙向信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被認(rèn)為是腫瘤血管生成的最重要分子信號之一。有學(xué)者指出，惡性腫瘤組織中EphrinB2配體通過雙向信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與相鄰內(nèi)皮細(xì)胞上的EphB4受體相結(jié)合后，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的芽生、增殖、遷移和管腔形成，并且這種腫瘤細(xì)胞還能夠作用于宿主血管，使腫瘤細(xì)胞的黏附性降低，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞滲入血管，引起腫瘤的轉(zhuǎn)移[17]。Ozgür等[18]研究發(fā)現(xiàn)，EphrinB2、EphB4蛋白可高表達(dá)于腫瘤組織的動靜脈中，兩者通過彼此的雙向信號的調(diào)節(jié)作用，在腫瘤血管的發(fā)生及腫瘤細(xì)胞在動靜脈內(nèi)皮的黏附和遷移過程中發(fā)揮重要作用。

有研究表明，EphB4/EphrinB2系統(tǒng)在多種惡性腫瘤組織如結(jié)直腸癌、乳腺癌、肺癌中高表達(dá)，且與腫瘤血管生成、侵襲及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[19]，但目前關(guān)于EphB4/EphrinB2系統(tǒng)所介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)通路對結(jié)直腸癌腫瘤血管生成、侵襲、轉(zhuǎn)移的影響，及其具體的分子生物學(xué)機制的研究相對較少。劉海燕等[20]的研究表明，EphB4受體和(或)EphrinB2的表達(dá)水平升高可能促進(jìn)腸道腫瘤的發(fā)生、分化和遷移，在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過程中起重要的作用。研究顯示，使用高度選擇性抗體阻斷EphrinB2的表達(dá)，能夠顯著抑制由VEGF誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和脈管系統(tǒng)的形成，最終遏制腫瘤的生長和復(fù)發(fā)[21]。韓強等[22]的研究表明，EphB4與VEGF蛋白在直腸癌的進(jìn)展中具有協(xié)同作用，推測EphB4可能通過VEGF在促進(jìn)腫瘤的血管生成過程中發(fā)揮重要作用。還有研究顯示，通過抑制EphB4蛋白的表達(dá)雖然不會影響到單層培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的增殖能力，但是可以使接種在裸鼠皮下的腫瘤體積明顯縮小，并使瘤體內(nèi)微血管密度減少[23]，這提示抑制劑可能是通過影響腫瘤組織內(nèi)癌細(xì)胞誘導(dǎo)的血管募集反應(yīng)來干擾瘤體內(nèi)血管形成，最終遏制腫瘤的生長。因此，雖然惡性腫瘤血管形成的機制目前尚未被完全闡明，但EphB4/EphrinB2系統(tǒng)與腫瘤的血管生成密切相關(guān)，并且在腫瘤組織中EphB4/EphrinB2系統(tǒng)可通過多種機制影響腫瘤血管的生成進(jìn)而影響腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)。由此推測，通過抑制腫瘤組織EphB4/EphrinB2蛋白的表達(dá)而干擾腫瘤的血管生成，或可抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，最終達(dá)到改善腫瘤患者預(yù)后的目的。

抗腫瘤血管生成治療已經(jīng)被公認(rèn)為是一種有效的抗腫瘤治療的方法[24]，其中，貝伐單抗可與VEGF結(jié)合并阻斷其生物活性，從而減少惡性腫瘤微血管生成，以發(fā)揮抗腫瘤作用。惡性腫瘤的血管生成是由多種作用機制共同協(xié)作實現(xiàn)的，所以通過單獨阻斷某一種因子以抑制惡性腫瘤血管生成而抗腫瘤復(fù)發(fā)，很難達(dá)到預(yù)期療效[25]。目前，各種分子靶向藥物對腫瘤的治療作用已經(jīng)獲得了循證醫(yī)學(xué)的證實，但是仍缺少通過中藥抑制相應(yīng)靶點來治療惡性腫瘤的研究。中醫(yī)認(rèn)為腫瘤是一種由于體內(nèi)正虛和邪實的共同存在，內(nèi)外因相互作用而產(chǎn)生的一種病理產(chǎn)物。臨床及實驗研究表明，中醫(yī)藥扶正祛邪法治療腫瘤不但可緩解臨床癥狀，改善患者生活質(zhì)量，延長生存期，還可提高患者免疫力，預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)[26-27]。消瘤湯以黨參、黃芪、紫河車為君藥，有以益氣血、鼓舞正氣、扶正祛邪的作用，以半枝蓮、山慈菇、扶芳藤、田七為臣藥，可活血化瘀、解毒散結(jié)、驅(qū)除余邪，佐以薏苡仁健脾利濕，全方攻補兼施，氣血并重，諸藥合用共奏扶正祛邪之功[28]。本研究結(jié)果顯示，中藥組、單抗組、聯(lián)合組腫瘤組織中的EphrinB2、EphB4蛋白表達(dá)水平均低于對照組，且中藥組和復(fù)合組均低于單抗組(均P<0.05)。這提示各治療組的治療方案均可抑制結(jié)直腸癌腫瘤組織中EphrinB2、EphB4蛋白的表達(dá)，且消瘤湯和消瘤湯聯(lián)合貝伐單抗的抑制作用均強于單一的聯(lián)合貝伐單抗。由此推測，消瘤湯可通過抑制結(jié)直腸癌腫瘤組織中Ephrin B2蛋白及其配體EPHB4蛋白的表達(dá)，從而阻礙腫瘤組織的新生血管生成。因此，在行靶向治療的同時服用消瘤湯，或可以提高抗腫瘤的效果。此外，中藥組和復(fù)合組EphrinB2、EphB4蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，提示這兩種方案的抑制作用相當(dāng)。原因可能為：在聯(lián)合用藥時，消瘤湯可能起主導(dǎo)作用，而貝伐單抗起輔助作用，兩者雖然作用方向一致，但仍不足以達(dá)到質(zhì)變的效應(yīng)，從而使中藥組和復(fù)合組的療效相當(dāng)。

綜上所述，消瘤湯能夠抑制EphrinB2、EphB4蛋白的表達(dá)，這為結(jié)直腸癌的臨床治療提供了新的思路和方法，EphB4及配體EphrinB2其或可成為今后治療結(jié)直腸癌的新靶點。