羅 迪，羅 棟,2，錢永強(qiáng)，孫振元

（1. 中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所 / 森林培育國家林業(yè)局重點實驗室，北京 100091；2. 廣東省深圳市福田區(qū)城市管理局，廣東 深圳 518036)）

克隆植物由各種等級的構(gòu)件組成，各個構(gòu)件通過連接物和間隔子進(jìn)行連接，形成一個形態(tài)和生理上相連的克隆系統(tǒng)[1]。自然生境中資源常呈異質(zhì)性分布，表現(xiàn)為濃度、尺度、格局和對比度上的差異[2-4]。為了適應(yīng)異質(zhì)生境，克隆植物通過節(jié)間連接，使光合同化物、水分、營養(yǎng)甚至信號分子在各克隆構(gòu)件間運輸和共享，即生理整合，并通過在不同部位表型可塑性修飾[5-8]，實現(xiàn)物質(zhì)與能量的最優(yōu)分配[9-10]，從而增強(qiáng)了克隆植物在棲息地中的競爭力和入侵能力[11-14]。因此，與非克隆植物相比，克隆植物表現(xiàn)出更強(qiáng)的空間拓展和生態(tài)適應(yīng)能力[15-17]。

生理整合是克隆植物區(qū)別于非克隆植物最主要的特征之一[18-19]。生理整合的發(fā)生是以感知異質(zhì)胞外信號為前提的。因此，探索克隆植物相連分株對異質(zhì)生境的應(yīng)答及適應(yīng)性機(jī)制，對解析克隆植物極強(qiáng)的生態(tài)適應(yīng)性、挖掘克隆植物的應(yīng)用潛力具有重要意義。野牛草(Buchloe dactyloides )是一種匍匐莖型克隆植物，可通過快速克隆生長，形成許多相對獨立或潛在獨立的克隆分株，組成不同等級的克隆構(gòu)件，連成一個形態(tài)和生理上相連的克隆分株系統(tǒng)[20-21]，是研究克隆植物對異質(zhì)生境響應(yīng)、生理整合以及對克隆植物表型可塑性影響的理想材料。

眾多研究表明，Ca2+是植物生長發(fā)育必需的營養(yǎng)元素，同時Ca2+作為重要的第2信使，通過胞內(nèi)鈣庫Ca2+的釋放及胞間Ca2+振蕩等時空動態(tài)變化，作為信號物質(zhì)的同時還可以結(jié)合細(xì)胞內(nèi)Ca2+受體鈣調(diào)蛋白(CaM)起作用，參與應(yīng)答多種非生物脅迫，并發(fā)揮著重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控機(jī)制[22-24]。

基于此，本研究對相連野牛草克隆分株設(shè)置了異質(zhì)性NaCl脅迫，利用非損傷微測技術(shù)測定正常條件和NaCl脅迫下野牛草克隆片段姊妹株根尖Ca2+凈流速量的方向和變化規(guī)律，研究野牛草分株根尖Ca2+流對NaCl脅迫的響應(yīng)及生理整合對相連分株根尖Ca2+流的調(diào)控作用，進(jìn)而為更深入地了解克隆植物對異質(zhì)生境的表型可塑性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料培養(yǎng)

野牛草通過克隆生長形成許多相對獨立的克隆分株，同一匍匐莖上可以先后形成多個克隆分株，通過間隔子相連的野牛草克隆分株形成一個相對獨立的克隆片段。選取長勢良好的野牛草單株培養(yǎng)于中國林業(yè)科學(xué)研究院科研溫室中以獲得大量匍匐莖。將匍匐莖節(jié)點浸于純凈水中24 h，使其生根，水量以剛沒過匍匐莖為準(zhǔn)。選取野牛草匍匐莖頂端開始數(shù)的第3株和第4株長勢一致、根長一致、生長成熟的相連克隆片段作為試驗材料。將克隆片段中較年輕的植株定義為妹株(第3株)，較老的植株(第4株)定義為姊株。

圖1 野牛草克隆分株的NaCl處理示意圖Figure 1 Buchloe dactyloides clonal fragments under NaCl stress

1.2 處理方法

1.2.1 NaCl處理

將克隆片段的相連姊妹株分別放置于兩個相鄰的、直徑為30 mm培養(yǎng)皿中，按處理每皿中加入20 mL相應(yīng)的含NaCl或不含NaCl測試液，平衡30 min后測定離子流的變化，穩(wěn)定后記錄。NaCl處理濃度為 200 mmol·L-1。共設(shè)置 4 個處理 (圖 1)，分別為，對克隆片段姊株進(jìn)行NaCl脅迫處理（T1）；對克隆片段妹株進(jìn)行NaCl脅迫處理(T2)；對克隆片段姊株和妹株同時進(jìn)行NaCl脅迫處理(T3)；對照不進(jìn)行NaCl脅迫處理(TCK)。每處理6個重復(fù)，分別測定姊株和妹株根尖Ca2+離子流。

1.2.2 LaCl3處理

將克隆片段的相連姊妹株分別放置于兩個相鄰的、直徑為30 mm培養(yǎng)皿中，按處理每皿中加入20 mL相應(yīng)的含NaCl或不含NaCl測試液。NaCl處理濃度為 200 mmol·L-1，LaCl3處 理 濃 度 為 20 mmol·L-1，每處理6個重復(fù)，設(shè)置4個處理(圖2)。分別為，用LaCl3處理相連克隆片段姊株30 min，對姊株進(jìn)行NaCl脅迫處理(TL1)；用LaCl3處理相連克隆片段妹株30 min，對妹株進(jìn)行NaCl脅迫處理(TL2)；用LaCl3處理相連克隆片段的姊株和妹株30 min，對姊株和妹株同時進(jìn)行NaCl脅迫處理(TL3)；用LaCl3處理相連克隆片段姊株 30 min，不進(jìn)行NaCl脅迫處理(TLCK)。處理后分別測定姊株和妹株根尖Ca2+離子流。

圖2 野牛草克隆分株的NaCl和LaCl3處理示意圖Figure 2 Buchloe dactyloides clonal fragments under NaCl stress and LaCl3 treatment

1.3 離子流測定

采用非損傷微測系統(tǒng)(Bio-IM NMT，美國揚(yáng)格公司)測定野牛草分株根系Ca2+離子流變化。測定部位為根尖分生區(qū)，距離根部頂端250 μm處。Ca2+測試液為 0.1 mmol·L-1CaCl2、0.1 mmol·L-1KCl、0.1 mmol·L-1MgCl2、0.5 mmol·L-1NaCl、0.2mmol·L-1Na2SO4、0.3 mmol·L-1MES，pH 6.0；鹽脅迫處理時 測 試 液 中 再 加 入 200 mmol·L-1NaCl。 低 濃度(0.05 mmol·L-1)Ca2+校 正 液 為 0.05 mmol·L-1CaCl2、0.1 mmol·L-1KCl、0.1 mmol·L-1MgCl2、0.5mmol·L-1NaCl、0.2 mmol·L-1Na2SO4、0.3 mmol·L-1MES，pH 6.5；高濃度 (0.5 mmol·L-1)Ca2+校正液為 0.5 mmol·L-1CaCl2、 0.1 mmol·L-1KCl 、 0.1 mmol·L-1MgCl2、0.5 mmol·L-1NaCl、0.2 mmol·L-1Na2SO4、0.3 mmol·L-1MES，pH 5.5。

將測定的數(shù)據(jù)代入Fick第一擴(kuò)散定律公式，計算 Ca2+流動速率[單位為 pmol·(cm2·s)-1]。公式如下：

J = -D·dc/dx。

式中：J為電極移動方向的離子流；dx為電極移動距離，dc為電極移動的兩點間的離子濃度差，D為測定離子的擴(kuò)散常數(shù)。離子流速計算結(jié)果為正值時表明Ca2+流出細(xì)胞(外流)；計算結(jié)果為負(fù)值時表明Ca2+流入細(xì)胞(內(nèi)流)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用單因素方差分析方法對各處理間姊株和妹株的Ca2+流差異進(jìn)行分析，并用Duncan檢驗進(jìn)行多重比較；利用獨立樣本T檢驗的方法比較相同處理下姊株和妹株間的Ca2+流差異；采用SPSS 16.0(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 姊妹克隆分株根尖Ca2+流對NaCl脅迫的響應(yīng)

各處理姊株根尖Ca2+凈流量均呈現(xiàn)外流的狀態(tài)(圖3)。與對照(CK)相比，NaCl脅迫下(T1、T2和T3)姊株根尖的 Ca2+凈外流量顯著增加 (P＜0.05)，但各NaCl脅迫處理間姊株根尖Ca2+凈流量并無顯著差異 (P ＞ 0.05)。

與姊株根尖離子流結(jié)果相似，各處理妹株根尖的Ca2+凈流量也均呈現(xiàn)外流的狀態(tài)(圖3)。與對照(CK)相比，單獨對妹株進(jìn)行NaCl脅迫(T2)和同時對姊妹株進(jìn)行NaCl脅迫時(T3)顯著提高了妹株根尖 Ca2+凈外流量 (P＜0.05)。而單獨對姊株進(jìn)行NaCl脅迫時(T1)，妹株根尖Ca2+凈流量并無明顯變化 (P ＞ 0.05)(圖 4)。

圖3 野牛草姊株和妹株根尖Ca2+凈流量對NaCl脅迫的響應(yīng)Figure 3 Ca2+ net flux responses of older and younger ramet root tips of Buchloe dactyloidesunder different NaCl treatments不同小寫字母表示不同處理間差異顯著(P＜0.05)。圖5同。Different lowercase letters indicate significant differences among different treatments at the 0.05 level; similarly for Figure 5.

圖4 野牛草姊妹株根尖Ca2+凈流速在相同NaCl脅迫下的差異Figure 4 Differences between Ca2+ net flux of older and younger ramet root tips of Buchloe dactyloides under the same NaCl stress*和**分別表示相同處理下姊妹株間差異顯著(P＜0.05)或極顯著 (P＜0.01)。圖 6 同。* and ** indicate significant differences between older and younger ramets under the same treatment at 0.05 and 0.01 levels, respectively;similarly for Figure 6.

2.2 相同NaCl脅迫下姊株和妹株根尖Ca2+流比較

對照(TCK)的姊株和妹株根尖Ca2+凈流量無顯著差異 (P ＞ 0.05)(圖 5)。單獨對姊株進(jìn)行 NaCl脅迫時(T1)，姊株根尖Ca2+凈外流量顯著高于妹株(P ＜0.05)。單獨對妹株進(jìn)行NaCl脅迫時(T2)，妹株根尖Ca2+凈外流量顯著高于姊株(P＜0.05)。對姊株和妹株同時進(jìn)行NaCl脅迫時(T3)，妹株根尖Ca2+凈外流量顯著高于姊株(P＜0.05)。

2.3 姊妹克隆分株根尖Ca2+流對LaCl3的響應(yīng)

LaCl3處理后，姊株根尖Ca2+仍呈現(xiàn)外流狀態(tài)，各處理間差異并未達(dá)到顯著水平 (P ＞ 0.05)(圖 6)。LaCl3處理后，妹株根尖Ca2+仍呈現(xiàn)外流狀態(tài)，各處理間差異也并未達(dá)到顯著水平(P ＞ 0.05)(圖5)。加入LaCl3后，姊株和妹株根尖Ca2+外流均增加，且與未加LaCl3處理對比差異達(dá)到極顯著水平 (P＜0.01)(圖 6)。

3 討論與結(jié)論

非損傷微測技術(shù) (non-invasive micro-test technique,NMT)也稱無損微測技術(shù)，是一種選擇性離子和分子檢測技術(shù)[25-27]。它利用特異性離子或者分子選擇性電極，在不損傷樣品的基礎(chǔ)上，測定多種離子和分子進(jìn)出活體樣品的流速、流量和流向，且具有極高的精準(zhǔn)度。非損傷微測技術(shù)在直接獲取組織或細(xì)胞外部分子和離子的信息方面具有明顯優(yōu)勢，目前已被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)的諸多領(lǐng)域[27]。

研究表明NaCl脅迫會引起植物細(xì)胞Ca2+濃度的升高[28]。植物細(xì)胞質(zhì)膜和內(nèi)膜系統(tǒng)上的鈣離子通道調(diào)控NaCl脅迫誘導(dǎo)Ca2+濃度升高。本研究中，野牛草姊株和妹株根尖Ca2+凈流量在所有處理中均呈現(xiàn)外流狀態(tài)，Ca2+外流主要通過位于質(zhì)膜上的電壓依賴型鈣泵完成。即當(dāng)膜電位去極化或超極化時，鈣泵被激活，Ca2+外流[28]。

NaCl脅迫會導(dǎo)致克隆植物的不同構(gòu)件對資源的吸收產(chǎn)生差異，從而使分株間形成資源的生理整合[15]。生理整合的發(fā)生以感知生境異質(zhì)信號為前提，而生理整合所引起的表型變化也是以信號調(diào)控為基礎(chǔ)的。野牛草克隆分株可以感知NaCl脅迫信號，引起克隆分株根尖Ca2+發(fā)生變化。不同生理整合條件下的克隆分株根尖Ca2+流存在差異。生長在正常營養(yǎng)條件下的姊株和妹株根尖Ca2+外流流速差異不明顯。當(dāng)對姊株進(jìn)行NaCl脅迫時，姊株感受到脅迫，Ca2+外流迅速增加，根據(jù)“收益-成本”原則[29]，姊株并沒有馬上將脅迫信號傳遞給妹株，因而妹株Ca2+外流變化不明顯。當(dāng)對妹株進(jìn)行NaCl脅迫時，妹株Ca2+外流迅速增加，同時妹株將脅迫信號傳遞給姊株，共同對脅迫作出響應(yīng)，姊株Ca2+外流也迅速增加，妹株Ca2+流速顯著高于姊株。當(dāng)姊株和妹株均受到NaCl脅迫時，姊株和妹株Ca2+外流均迅速增加，且妹株Ca2+流速顯著高于姊株。野牛草姊妹株間存在NaCl信號的整合，調(diào)控了NaCl脅迫下野牛草分株根尖Ca2+流的變化。

圖5 野牛草根尖Ca2+凈流速對LaCl3脅迫的響應(yīng)Figure 5 Ca2+ net flux responses of Buchloe dactyloides root tips to different LaCl3 treatments

圖6 LaCl3對野牛草根尖Ca2+凈流速的影響Figure 6 Effects of LaCl3 on Ca2+ net flux of Buchloe dactyloides root tips

LaCl3阻斷了Ca2+通道，阻止分株間Ca2+的運輸。存在營養(yǎng)生理整合的克隆分株用LaCl3處理后雖然會引起根尖Ca2+外流增加，但各NaCl脅迫處理下Ca2+外流與對照相比差異均不顯著。LaCl3阻斷了分株間Ca2+的運輸，NaCl脅迫信號不能被克隆分株根尖所感知并在分株間轉(zhuǎn)導(dǎo)。這證明，Ca2+參與克隆分株對異質(zhì)營養(yǎng)的感知和應(yīng)答，調(diào)控了克隆分株間的營養(yǎng)生理整合。