賈 彤，馬賽男，雍 斌，張 艷，吳 星，李 州，彭 燕

（四川農(nóng)業(yè)大學草學系，四川 成都 611130）

白三葉(Trifolium repens)是世界范圍內(nèi)廣泛栽培的多年生豆科牧草，具有營養(yǎng)價值高、莖葉豐富、適口性好等特性，為各種畜禽所喜食。此外，由于其具有根系固氮能力強、再生恢復速度快、顏色碧綠均勻、綠期長等特點，也是庭院、城市綠化建植和水土保持的重要草種[1]。然而，由于受全球氣候變化的影響，極端氣候事件出現(xiàn)的頻率和強度明顯增加，諸如白三葉等作物以及生長在自然環(huán)境中的各種植物常常容易受到多種環(huán)境脅迫的危害[2]；同時國內(nèi)土地鹽堿化、重金屬污染也日益嚴峻，嚴重影響植物的生長發(fā)育，也限制了作物的產(chǎn)量和品質(zhì)[3]。當前雖然通過雜交育種、栽培管理、外源植物生長調(diào)節(jié)劑等方法改善白三葉抗逆能力，但仍需不斷探尋更有效的方法以應(yīng)對日益嚴峻的環(huán)境形勢，其中，與抗逆相關(guān)基因的挖掘與應(yīng)用受到高度關(guān)注，并成為研究熱點[4]。

轉(zhuǎn)錄因子是植物中最重要的調(diào)控蛋白，幾乎參與了生物體內(nèi)所有的生命過程，研究表明多種類型的轉(zhuǎn)錄因子參與植物的抗逆應(yīng)答反應(yīng)，例如AP2、bZIP、MYB、NAC 和 Zinc finger類 轉(zhuǎn)錄 因子[5-7]。MYB家族轉(zhuǎn)錄因子是植物中最大的一類轉(zhuǎn)錄因子家族，其蛋白在結(jié)構(gòu)上具有由1～4個MYB重復單元組成的MYB結(jié)構(gòu)域，根據(jù)MYB結(jié)構(gòu)域所含MYB重復個數(shù)，MYB家族轉(zhuǎn)錄因子被分為4種類型，即包含4個MYB重復的4R-MYB、3個MYB重復的3R-MYB、2個MYB重復的R2R3-MYB及1RMYB類型的MYB轉(zhuǎn)錄因子家族[8]。在每個MYB重復內(nèi)部會形成3個α-螺旋結(jié)構(gòu)，其中靠近C末端的兩個α-螺旋(第2個和第3個)會形成螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)域(HTH)，參與對靶序列的識別和作用[9]。每個MYB重復通常包含50～53個氨基酸，在每個MYB重復多肽鏈上一般都含有3個保守色氨酸殘基，它們相互之間間隔18或19個氨基酸，這3個色氨酸殘基形成一個疏水核心，這對于維持HTH的構(gòu)型以及MYB蛋白同靶DNA之間相互作用具有重要意義[10]。

隨著植物中第一個MYB轉(zhuǎn)錄因子在玉米(Zea May)中被發(fā)現(xiàn)[11]，大量編碼MYB轉(zhuǎn)錄因子的基因被分離鑒定。近年來，人們對植物MYB轉(zhuǎn)錄因子的功能也進行了廣泛的研究，越來越多的MYB轉(zhuǎn)錄因子功能被揭示，研究發(fā)現(xiàn)MYB轉(zhuǎn)錄因子是一類多功能蛋白家族，它參與了生物體中多個生命過程的調(diào)節(jié)，如參與植物初級和次級代謝的調(diào)節(jié)，細胞發(fā)育、形態(tài)建成及細胞周期的調(diào)控，植物激素合成及信號傳導的調(diào)控，植物生物和非生物脅迫的應(yīng)答調(diào)控等[9,12-13]。盡管對MYB家族轉(zhuǎn)錄因子的抗逆功能報道較多，但有關(guān)白三葉MYB轉(zhuǎn)錄因子的抗逆相關(guān)研究較少。本研究通過RT-PCR以及RACE技術(shù)克隆白三葉目標基因(MYB1R1)全長，對其進行生物信息學分析，并采用熒光定量PCR對該基因在不同非生物脅迫和激素誘導下進行轉(zhuǎn)錄表達分析，研究結(jié)果為進一步研究MYB1R1在白三葉中的生物學功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與主要試劑

本研究采用廣泛栽培的品種‘拉丁諾'(Landino)白三葉為試驗材料。

RNA 提取試劑盒 (RNAprep Pure Plant Kit)、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒 (TIANgel Midi Purification Kit)及 DH5α 感受態(tài)細胞購于 TIANGEN Biotech公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(iScriptTM Ⅱ Strand cDNA Synthesis Kit)購于 Bio-Rad Laboratories公司；RACE試劑盒 (SMARTer? RACE 5′/3′Kit User Manual)、PCR反 應(yīng) 用DNA 聚 合 酶 (PrimeSTAR Max DNA Polymerase)、DNA A-Tailing Kit試劑、pMDTM19-T Vector Cloning Kit試 劑 及 熒 光 定 量 試 劑 (SYBR Premix Ex Taq II)購于 TaKaRa 公司；其他化學試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 RT-PCR擴增和序列測定

利用RNA提取試劑盒提取白三葉葉片總RNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得cDNA。根據(jù)NCBI上公布的蒺藜苜蓿(Medicago truncatula，EF468475.1)和鷹嘴豆(Cicer arietinum，XM_0127 18141.1)MYB 基 因 序 列 ， 采 用 Primer Premier 5.0設(shè) 計 簡 并 引 物 MYB1R1 1F 和 MYB1R1 1R(表 1)，進行PCR擴增，擴增體系為50 μL。PCR擴增程序為：94 ℃ 預(yù)變性 5 min，98 ℃ 變性 10 s，55 ℃ 退火 5 s，72 ℃ 延伸 5 s，35 個循環(huán)。PCR 反應(yīng)完成后，PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將產(chǎn)物切膠純化后，連接到pMD19-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選陽性克隆，將正確菌液送至華大基因公司測序。

表1 基因克隆及熒光定量引物信息Table 1 Primers used in this study

1.3 RACE反應(yīng)克隆MYB1R1轉(zhuǎn)錄因子全長

參照RACE試劑盒，以1.2提取的總RNA為模板，分別合成5′RACE和3′RACE所需cDNA，利用測序所得部分序列設(shè)計RACE特異性引物MYB1R1-5和MYB1R1-3(表1)。PCR反應(yīng)參照RACE試劑盒進行，反應(yīng)體系為50 μL。擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后，回收純化，連接轉(zhuǎn)化，篩選陽性克隆進行測序。運用DNAMAN軟件將測序所得RT-PCR與RACE反應(yīng)所得片段進行基因全長序列拼接，利用ORF Finder預(yù)測開放閱讀框(ORF)，設(shè)計特異性引物 MYB1R1 2F 和 MYB1R1 2R(表 1)進行 ORF 驗證。

1.4 生物信息學分析

采用在線分析軟件Protparam、NetPhos、SOPMA、SMART、Psort及SWISS-MODEL對該基因編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、磷酸化位點、二級結(jié)構(gòu)、功能結(jié)構(gòu)域、三維空間結(jié)構(gòu)和亞細胞定位分析。在NCBI上檢索同源序列，使用MEGA 5.1進行進化樹分析。

1.5 基因表達模式分析

將白三葉種子經(jīng)5% NaClO消毒后，均勻播種于石英沙盤中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[23 ℃/19 ℃(光照/黑暗)，光周期為12 h，相對濕度75%，光強700 μmol·(m2·s)-1]。蒸餾水培養(yǎng) 7 d，進行發(fā)芽；之后換用Hoagland全營養(yǎng)液培養(yǎng)，每隔1 d替換一次營養(yǎng)液，待幼苗培養(yǎng)30 d后，取長勢一致的幼苗處理。將幼苗先置于蒸餾水中漂洗，隨后置于含處理液的離心管中，處理液均用蒸餾水配制。脅迫處理為 15% PEG (模擬干旱脅迫)、200 mmol·L-1NaCl(鹽 脅 迫)、 600 μmol·L-1CdSO4(重 金 屬 鎘 脅迫)、4 ℃(冷處理)及 35 ℃(高溫處理)，取樣時分別剪取幼苗葉片和根部。激素處理為100 μmol·L-1的 脫 落 酸 (ABA) 和 100 μmol·L-1的 細 胞 分 裂素(CTK，6-BA)，取樣時僅剪取幼苗葉片。分別在處理0、1.5、3、6、12和24 h進行取樣。取樣后立即將樣品放入液氮中冷凍，提取樣品總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，作為熒光定量表達模板。

以實驗室篩選的肌動蛋白基因(β-Actin)為內(nèi)參，引物為 β-Actin F 和 β-Actin R(表 1)，根據(jù)已克隆獲得基因全長序列設(shè)計特異性引物MYB1R1 3F和MYB1R1 3R(表1)，參照熒光定量試劑盒進行試驗。反應(yīng)體系為10 μL，每個處理設(shè)置4次獨立生物學重復，PCR擴增程序為：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，63 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸 30 s，共 40 個循環(huán)。

2 結(jié)果與分析

2.1 白三葉TrMYB1R1基因序列全長分析

以白三葉葉片cDNA為模板，利用簡并引物，通過RT-PCR反應(yīng)得到一條長約700 bp的條帶，經(jīng)測序得到預(yù)期保守序列。通過5′RACE和3′RACE技術(shù)獲得基因兩端序列。運用DNAMAN 軟件拼接RT-PCR與RACE反應(yīng)所得片段，并利用ORF Finder預(yù)測開放閱讀框，設(shè)計ORF引物對拼接序列進行驗證。結(jié)果顯示TrMYB1R1基因(已上傳GenBank但未公開，登錄號為KX940980)cDNA序列全長1 403 bp(紅色方框標注分別為起始密碼子和終止密碼子)，其中 5′端非編碼區(qū)序列長 140 bp，3′端非編碼區(qū)序列長 369 bp，開放閱讀框共 894 bp，編碼297個氨基酸殘基(圖1)。

2.2 白三葉TrMYB1R1基因編碼的蛋白特性

利用Protparam分析TrMYB1R1編碼蛋白質(zhì)的分子式為C1407H2233N423O464S11，相對分子質(zhì)量為32.8514 kDa，等電點為 8.5；正電荷殘基 (Arg + Lys)為31個，負電荷殘基(Asp + Glu)為33；不穩(wěn)定系數(shù)為60.03，屬不穩(wěn)定蛋白；平均親水性系數(shù)為-0.716，為親水性蛋白。NetPhos預(yù)測蛋白可能的磷酸化位點，發(fā)現(xiàn)其含有44個磷酸化位點(33個絲氨酸、10個蘇氨酸及1個酪氨酸)，這些位點的存在說明TrMYB1R1蛋白翻譯后還需多種修飾作用，以調(diào)節(jié)蛋白表達水平。

SOPMA預(yù)測TrMYB1R1蛋白的二級結(jié)構(gòu)如圖2所示，該蛋白含有較多的延伸鏈和無規(guī)則卷曲，其中α-螺旋(Hh)由47個氨基酸殘基組成，占15.82%；延伸鏈(Ee)由67個氨基酸殘基組成，占22.56%；β-轉(zhuǎn)角(Tt)由13個氨基酸殘基組成，占4.38%；無規(guī)則卷曲(Cc)由170個氨基酸殘基組成，占57.24%。SMART分析該基因的保守結(jié)構(gòu)域(圖3)，發(fā)現(xiàn)TrMYB1R1編碼的蛋白在靠近N端位置含有一個MYB保守結(jié)構(gòu)域R88-R138，為MYB-related 類型轉(zhuǎn)錄因子，同時含有3個低復雜度區(qū)域，分別位于D42-D61、N223-F235和 T242-L263。用 SWISS-MODEL 模擬MYB1R1的三維結(jié)構(gòu)(圖4)，其保守序列含有3個α-螺旋有助于其折疊成正確的蛋白結(jié)構(gòu)。利用Psort對TrMYB1R1蛋白進行亞細胞定位預(yù)測，結(jié)果顯示在細胞核的可信度較高，為0.600，因此該蛋白可能定位于細胞核中，這與轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄作用的功能相符合。

圖2 TrMYB1R1轉(zhuǎn)錄因子的二級結(jié)構(gòu)Figure 2 The predicted secondary structure of TrMYB1R1

圖3 TrMYB1R1轉(zhuǎn)錄因子蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析Figure 3 The conserved domain of TrMYB1R1

圖4 TrMYB1R1轉(zhuǎn)錄因子蛋白三維結(jié)構(gòu)Figure 4 The three-dimensional structure of TrMYB1R1

利用BLAST軟件搜索與白三葉TrMYB1R1轉(zhuǎn)錄因子蛋白同源性較高的序列，再通過MEGA5.0軟件運用Neighbour-Joining方法構(gòu)建同源進化樹(圖5)。根據(jù)系統(tǒng)進化樹可知，TrMYB1R1轉(zhuǎn)錄因子的進化基本符合植物進化分類，相同科的植物聚為同一小類。白三葉、鷹嘴豆(Cicer arietinum)和蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)聚于一個小的進化分支，表明它們具有較近的親緣關(guān)系；且白三葉與同一科的植物大豆(Glycine max)、木豆(Cajanus cajan)、菜豆(Phaseolus vulgaris)等植物進化關(guān)系也較近，與蔓花生(Arachis duranensis)、落花生(Arachis hypogaea)等植物的進化關(guān)系相對較遠。而白三葉與其他科屬植物如蕓香科的甜橙(Citrus sinensis)、薔薇科的蘋果(Malus domestica)和白梨(Pyrus x bretschneideri)、葫蘆科的甜瓜(Cucumis melo)和黃瓜(Cucumis sativus)、茄科的美花煙草(Nicotiana sylvestris)的親緣關(guān)系相較與同一科植物而言相距更遠。

2.3 非生物脅迫處理下白三葉TrMYB1R1基因的表達譜

為了研究非生物脅迫對白三葉TrMYB1R1的影響，采用實時熒光定量PCR方法，分析了干旱(15% PEG-6000)、冷 (4 ℃)、熱 (35 ℃)、重金屬鎘(600 μmol·L-1CdSO4) 和 鹽 (200 mmol·L-1NaCl)5 種脅迫條件下TrMYB1R1在葉片和根系中的動態(tài)表達(圖6)。在干旱、熱、鎘3種脅迫處理下，TrMYB1R1表達量均呈現(xiàn)不同程度的下調(diào)，且根與葉都呈現(xiàn)“降-升-降”的表達趨勢(圖6A-D)。PEG和冷處理后，TrMYB1R1轉(zhuǎn)錄因子在葉片表達的變幅均較根部明顯，但在相同處理條件下不同處理時間長度，基因在葉片與根部的表達趨勢均同步。PEG脅迫下，TrMYB1R1在處理1.5 h表達量顯著降低，3 h表達量緩慢升高，6 h升至最高達到正常水平，而后基因表達量又開始降低(圖6A)。冷處理后，TrMYB1R1在處理 1.5 h表達量下降，3 h表達量上升，而后又下降(圖6B)。熱處理后，基因在葉片和根中的表達皆明顯下調(diào)，其中，0～3 h期間，葉片中下降程度較根中更為明顯，3 h以后則是根中的下降程度較葉更為明顯(圖6C)。鎘處理后，在1.5 h時TrMYB1R1在根與葉的表達量均下降，但3 h時基因在葉片的表達量已上升，而根部還處于下降趨勢，處理6 h才開始上升(圖6D)。

與干旱、冷、熱和鎘處理總體抑制TrMYB1R1表達不同，NaCl處理后，葉片中的TrMYB1R1整體呈上調(diào)趨勢，在處理1.5 h時，表達量雖有較小程度 地降低，但處理 3 、6 和 12 h 時表達量則持續(xù)上升，處理12 h時的表達量約為0 h的4倍；而根部的TrMYB1R1表達在早期則受到一定程度的抑制，后期與脅迫前的水平相近(圖6E)。以上結(jié)果表明，白三葉TrMYB1R1基因?qū)Σ煌{迫處理均有響應(yīng)，但表達模式存在差異，且在根系和葉片中的表達水平差異明顯。在干旱、鎘、冷和熱處理下，白三葉TrMYB1R1基因葉片和根系的表達整體受到抑制；而在NaCl處理下，該基因在葉片中被上調(diào)表達，在根中被下調(diào)表達。

圖5 TrMYB1R1轉(zhuǎn)錄因子與其他植物同源氨基酸的系統(tǒng)進化樹Figure 5 The phylogentic tree of TrMYB1R1 and other plant species

2.4 植物激素處理下白三葉TrMYB1R1基因的表達變化

TrMYB1R1對兩種激素處理均有響應(yīng)(圖7)，但響應(yīng)模式有差異。ABA處理下，TrMYB1R1表達呈現(xiàn)先下降再上升的趨勢，ABA處理前期抑制了該基因的表達，12 h后回升至正常水平(圖7A)；而不同的是，CTK處理后TrMYB1R1的表達量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，且表達水平差異顯著，CTK誘導處理6 h時TrMYB1R1表達量達到最高，與0 h相比高出近10倍，表明CTK能誘導TrMYB1R1轉(zhuǎn)錄因子的表達(圖7B)。

3 討論

轉(zhuǎn)錄因子通過與DNA上的順式作用元件結(jié)合，并通過與其他相關(guān)蛋白作用，在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控目標基因在特定時空下、特定強度的表達，進而實現(xiàn)細胞內(nèi)特定生理生化的調(diào)控。典型的轉(zhuǎn)錄因子在結(jié)構(gòu)上通常包括3個功能區(qū)：DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、轉(zhuǎn)錄調(diào)控結(jié)構(gòu)域以及核定位信號。其中，DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域決定了轉(zhuǎn)錄因子與順式作用元件之間結(jié)合的特異性，轉(zhuǎn)錄調(diào)控結(jié)構(gòu)域?qū)崿F(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控功能[14]。在長期的進化過程中，一些轉(zhuǎn)錄因子盡管功能可能完全不同，但它們的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域卻高度保守。本研究從白三葉中克隆出1條MYB基因TrMYB1R1，并用生物信息學方法對TrMYB1R1進行分析與預(yù)測。結(jié)果表明TrMYB1R1 基因全長 1 403 bp，編碼 297個氨基酸殘基，含有一個MYB結(jié)構(gòu)域，保守域形成3個α-螺旋，屬于MYB-related蛋白；為親水性蛋白，可能定位于細胞核中；進化分析表明該蛋白符合植物進化分類。研究也表明，磷酸化反應(yīng)可在多種生物學途徑中有著重要意義[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，TrMYB1R1蛋白有多個磷酸化位點，這些位點的存在說明TrMYB1R1蛋白翻譯后還需多種修飾調(diào)控，以調(diào)節(jié)蛋白表達水平。

據(jù)報道，MYB-related轉(zhuǎn)錄因子參與合成代謝物質(zhì)[16-17]、光周期反應(yīng)[17]等。GmMYB176參與大豆異黃酮的合成過程，沉默GmMYB176可降低異黃酮在根部的積累[16]。蒺藜苜蓿MYB2是一個調(diào)節(jié)花青素與原花青素(PA)合成的轉(zhuǎn)錄阻遏因子，過表達MYB2可以消除蒺藜苜蓿根毛和擬南芥種子中的花青素和原花色素的積累[17]。GmMYB173是在大豆中運用酵母單雜交篩選出的與GmFT2a(與光周期相關(guān)基因)順式作用元件相結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，實時熒光定量分析發(fā)現(xiàn)GmMYB173在長日照條件下表達量升高，推測其可減輕長日照對大豆生殖發(fā)育的影響[18]。本研究克隆得到的轉(zhuǎn)錄因子TrMYB1R1是否也參與了調(diào)節(jié)白三葉體內(nèi)次生代謝的積累有待于后續(xù)進一步研究。

圖7 激素處理條件下白三葉葉片TrMYB1R1的表達量Figure 7 The transcript level of TrMYB1R1 in response to ABA and CTK

MYB-related轉(zhuǎn)錄因子也參與植物非生物脅迫應(yīng)答反應(yīng)[18-20]。鷹嘴豆1R-MYB是從鷹嘴豆不同耐旱基因型中篩選出來的轉(zhuǎn)錄因子，該基因在干旱耐受型和敏感型之間表達差異較大，通過酵母雙雜交分析發(fā)現(xiàn)其可調(diào)節(jié)鷹嘴豆抗旱應(yīng)答機制[19]。水稻OsMYB48可被干旱、ABA強烈誘導表達；在過表達OsMYB48情況下，干旱脅迫可誘導內(nèi)源ABA的積累，并調(diào)節(jié)一些ABA合成基因(OsNCED4、OsNCED5)、早期信號基因(OsPP2C68、OSRK1)和晚期響應(yīng)基因(RAB21、OsLEA3、RAB16C和RAB16D)的表達[20]。GmMYB174基因在ABA和干旱處理下的表達量下調(diào)，在NaCl處理下表達量上調(diào)，表明其在不同脅迫下表達模式不同[21]。本研究對白三葉進行非生物脅迫處理，定量分析表明在PEG、鎘、冷及熱處理下，白三葉TrMYB1R1轉(zhuǎn)錄因子在根和葉中的表達受到抑制，且在鎘、冷及熱處理下所受到的抑制較PEG脅迫下強；而在NaCl處理下該基因受到誘導表達，表明該基因在不同脅迫處理下其表達模式有所不同。同時，脅迫處理下TrMYB1R1在根部與葉片的表達量相比較，可看出該基因在葉片中表達差異更明顯，對脅迫處理更加敏感。在擬南芥(Arabidopsis thaliana)中研究表明MYB-related轉(zhuǎn)錄因子參與葉片毛狀體形成[22]，在葉片中表達更為活躍，這與本研究中TrMYB1R1在白三葉葉片中表達差異更明顯的結(jié)果相一致。同時，本研究采用ABA和CTK處理白三葉，發(fā)現(xiàn)葉片中TrMYB1R1對這兩種外源激素均有響應(yīng)。在ABA處理下，TrMYB1R1表達下調(diào)，且在PEG處理下基因表達也下調(diào)(脫水或干旱常常誘導ABA濃度升高)，表明TrMYB1R1在干旱脅迫下的調(diào)控可能屬于負調(diào)控。在CTK處理下，TrMYB1R1在葉片中的表達被強烈誘導。據(jù)報道，CTK會誘導花青素合成途徑中MYB基因的表達[23]。推測白三葉TrMYB1R1不僅參與非生物脅迫途徑，還有可能參與花青素合成反應(yīng)，但仍有待于進一步研究其作用機制。

本研究克隆了白三葉TrMYB1R1基因的編碼序列，對基因序列的生物信息學分析以及實時熒光定量分析，表明該基因可能參與多種非生物脅迫應(yīng)答機制及其他生物學反應(yīng)途徑，但要明確TrMYB1R1在白三葉中的功能及調(diào)控作用，仍需進一步研究。