伍一寧，鐘海秀，王繼豐，隋 心，張榮濤，李金博，王麗媛，張 玉，王世標，許 楠，鄒紅菲

（1. 東北林業(yè)大學野生動物資源學院，黑龍江 哈爾濱 150040；2. 黑龍江省科學院自然與生態(tài)研究所，黑龍江 哈爾濱 150040；3. 黑龍江大學生命科學學院，黑龍江 哈爾濱 150080；4. 環(huán)境保護監(jiān)測站，內蒙古 赤峰 024076）

濕地生態(tài)系統(tǒng)雖然僅占陸地面積的4%～6%，但濕地是陸地生態(tài)系統(tǒng)最為重要的“碳庫”或“碳匯”，濕地生態(tài)系統(tǒng)中動植物資源豐富，具有重要生態(tài)價值[1-3]。三江平原濕地是由黑龍江、松花江、烏蘇里江沖積而形成的低平原, 是我國最大的沼澤濕地集中區(qū)，并于2002年被列入國際重要濕地名錄[4]。三江平原濕地在調節(jié)當?shù)貧夂颉⒖刂茲袷覛怏w排放和碳固定方面發(fā)揮著重要的作用，具有重要的生態(tài)價值。目前由于人類的大面積濕地墾殖，濕地生態(tài)系統(tǒng)遭到破壞。三江平原由于近幾十年來的大規(guī)模過度開發(fā)，濕地面積已大量減少，水土流失日趨嚴重，生物多樣性銳減，環(huán)境污染與日俱增[5-6]。

濕地退化的主要表現(xiàn)為水分含量的降低，直接會導致濕地土壤有機碳的礦化、濕室氣體排放量增加、全球氣候變化。水分是影響濕地生態(tài)系統(tǒng)生物多樣性的重要因素之一[7-8]，已有研究表明，不同水分梯度下三江平原濕地特種組成及多樣性[9-10]、土壤細菌[11]、真菌[12]多樣性、土壤酶活性[13]等均發(fā)生了明顯的變化。水分也是影響植物生理功能的重要限制因子，不同植物對水分的需求量明顯不同，干旱或水分過多均會限制植物的生理功能[14-15]，但是濕地植物由于生長在長期或季節(jié)性淹水條件下，使其具有獨特的生理生態(tài)適應機制。目前，關于對不同水分梯度下濕地植物漂筏苔草(Carex pseudocuraica)[16-17]、小葉章(Deyeuxia angustifolia)[18]等植物生長方面的研究已有報道，但是關于不同水分梯度下濕地優(yōu)勢植物小葉章光合生理適應性方面的研究尚不多見，既然小葉章能作為三江平原濕地的典型優(yōu)勢種，那么小葉章對不同水分環(huán)境下的生理適應機制是什么？光合能力是植物維持正常生長的基礎保障，特別是植物光合作用中PSII功能在植物對光能的吸收和利用方面具有重要的意義，而PSII又是對環(huán)境因素比較敏感的部位之一，逆境條件下常常導致植物PSII功能降低，甚至發(fā)生光抑制現(xiàn)象[19-20]。為此，本研究選擇三江平原濕地內典型的沼澤(常年積水)、沼澤化草甸(季節(jié)性積水)和草甸(地表無積水)3 個不同水分梯度下濕地類型小葉章為試驗材料，利用葉綠素熒光動力學技術研究了不同水分梯度下濕地小葉章葉片的PSII功能變化，擬通過光合功能方面來揭示小葉章對水分梯度的適應機理，以期為三江平原濕地優(yōu)勢植物小葉章的深入研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗樣地概況

試驗樣地設在黑龍江省洪河國家級保護區(qū)(47°45′39″ N, 133°37′04″ E)，該地區(qū)海拔 55-65 m，屬溫帶濕潤半濕潤季風氣候，全年平均降水量約為600 mm，降水主要集中在夏秋兩季，全年平均氣溫1.9 ℃，無霜期約為125 d[21]，本試驗樣品采集區(qū)域位于整個洪河保護區(qū)的核心區(qū)域，濕地優(yōu)勢植物主要有小葉章和漂筏苔草，伴有少量的狹葉甜茅(Glyceria spiculosa)、毛果苔草(Carex lasiocarpa)等。

不同水分梯度濕地土壤樣品的采集及含水率測定：分別選擇典型沼澤(常年積水)、沼澤化草甸(季節(jié)性積水)和草甸(地表無積水)3個不同水分梯度濕地類型，每個水分梯度類型內按“S型”各取5個點土樣進行混合，采樣深度0～20 cm，沼澤排除水面采取0～20 cm土樣。土壤樣品用塑料封口袋帶回實驗室后，采用烘干法進行土壤含水率的測定。土壤含水率分別為185%、86%和75%。每個濕地類型內選擇5株長勢相對一致的小葉章，分別測定其PSII反應中心的光化學活性。

1.2 測定項目及其方法

1.2.1 測定快速葉綠素熒光動力學 (OJIP)曲線

利用暗適應夾將不同水分梯度下濕地小葉章葉片進行30 min的暗適應，然后利用Handy-PEA植物效率儀測定葉片的OJIP曲線，OJIP曲線由3 000 μmol·(m2·s)-1的脈沖紅光誘導。每個處理測定 5 次重復，按照每次重復OJIP曲線各時間點的熒光強度求其平均值，按照平均值繪制OJIP曲線，曲線橫坐標以對數(shù)形式表示。為分別確定J、I、K和L 4個特征點的相對可變熒光VJ、VI、VK和VL，分別將OJIP曲線進行O-P、O-J和O-K標準化[22]。在曲線中，O、L、K、J、I和P點對應的時刻分別為 0、0.15、0.3、2、30 和 1 000 ms，通過對曲線O-P階段進行標準化得出各點的相對可變熒光VO-P= (Ft- Fo) / (Fm- Fo)，對 O-J 階段進行標準化得出各點的相對可變熒光 VO-J= (Ft- Fo) / (FJ-Fo)，O-K 標準化時各點的相對可變熒光 VO-K= (Ft- Fo) /(FK-Fo)， 式中：Ft表示各時間點的熒光強度，F(xiàn)o、FK、FJ、Fm分別為O、K、J和P點的相對熒光強度。分別用沼澤化草甸及草甸小葉章的標準化O-P、O-J和O-K曲線與沼澤小葉章作差值，差值分別以△VO-P、△VO-J和△VO-K表示。通過JIP-test軟件分析得出植株葉片的PSII最大光化學效率(Fv/ Fm)和以吸收光能為基礎的光合性能指數(shù)(PIABS)[23]。

1.2.2 測定植物葉片葉綠素熒光光響應曲線

對植株葉片儀器自帶暗適應夾進行暗適應25～30 min后，使用便攜調制式熒光儀(FMS-2，Hansatech, 英國)測定最大熒光(Fm)、初始熒光(Fo)，隨后利用FMS-2的內置光源分別設定100、200、400、600、800 和 1 000 μmol·(m2·s)-1的不同光強的作用光，在設定的光強下適應 3 min后測定其葉片的熒光參數(shù)光適應下的最大熒光(Fm′)、光適應下的最小熒光(Fo′)及穩(wěn)態(tài)熒光(Fs)，分別計算不同作用光下的實際光化學效率(ФPSⅡ)和電子傳遞速率 (ETR)，ФPSⅡ= (Fm/ Fs) / Fm′，ETR = 0.5 ×0.85 × ФPSⅡ× PFD， 式中 PFD 為光照強度，并繪制ФPSⅡ和ETR 的光響應曲線。

1.2.3 測定 PSII反應中心光能分配參數(shù)

對不同水分梯度下濕地小葉章葉片利用儀器自帶的暗適應夾進行25～30 min的暗適應，利用FMS-2按照Hendrickson等[24]和Zhou等[25]的方法測定PSII反應中心吸收光能的分配去向：用于光化學反應的量子產額(ФPSⅡ)、依賴于類囊體膜兩側質子梯度和葉黃素循環(huán)的量子產額(ФNPQ)、基本的熒光量子產額和熱耗散的量子產額(Фf,D)以及失活PSII反應中心的熱耗散量子產額(ФNF)，其中各部分參數(shù)的計算方法為：

式中：Fs為穩(wěn)態(tài)熒光，F(xiàn)v為可變熒光，F(xiàn)m′為光適應下的最大熒光，F(xiàn)v/ FmM為未發(fā)生光抑制時的最大光化學效率。其各部分的總和計為 1，即ФNF+ ФPSⅡ+ФNPQ+ Фf,D= 1。

1.3 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計方法

數(shù)據(jù)測定為5次重復的平均值 ± 標準差(SE)，運用Excel進行數(shù)據(jù)平均值測定，SPSS(23.0)軟件對試驗數(shù)據(jù)進行標準差統(tǒng)計分析，并采用單因素方差分析(One-way ANOVA)和最小顯著差異法(LSD)比較不同數(shù)據(jù)組間的差異。

2 結果與分析

2.1 不同水分梯度下濕地小葉章葉片的OJIP曲線

不同水分條件下小葉章葉片的OJIP曲線形態(tài)明顯不同。沼澤化草甸和草甸小葉章葉片的OJIP曲線形態(tài)比較相似。與沼澤小葉章相比，沼澤化草甸和草甸小葉章葉片O點的相對熒光強度Fo均明顯降低，而P點的相對熒光強度Fm則呈明顯的增加趨勢，J點相對熒光強度在不同水分梯度下變化不明顯，而沼澤化草甸和草甸小葉章葉片I點相對熒光強度較沼澤也明顯增加，但其增加幅度明顯小于P點的增加幅度(圖1)。定量分析Fo和Fm的變化結果(圖2)可以看出，沼澤化草甸和草甸小葉章葉片的Fo分別較沼澤降低了29.33%和24.08%，均達極顯著差異水平(P＜0.01)，而Fm則分別增加了 14.57% 和 19.88%，差異均不顯著 (P ＞ 0.05)。

2.2 不同水分梯度下濕地小葉章葉片的 Fv/Fm和PIABS

沼澤小葉章葉片的Fv/ Fm分別低于沼澤化草甸和草甸19.27%和18.50%，差異均顯著(P＜0.05)；沼澤小葉章葉片PIABS分別低于沼澤化草甸52.54%，低于草甸72.73%，差異不顯著(P ＞ 0.05)。沼澤化草甸和草甸小葉章葉片的Fv/Fm和PIABS均不顯著(P ＞ 0.05)(圖 3)。

圖1 不同水分梯度濕地小葉章葉片的OJIP曲線Figure 1 Chlorophyll fluorescence characteristics of Deyeuxia angustifolia leaves across a water gradientO, 最低熒光; P, 熒光最高峰; J 和 I, O-P 點的變化中的拐點; Ma,沼澤; Ml, 沼澤化草甸; Me, 草甸。下同。O, Minimal recorded fluorescence; P, Maximal recorded fluorescence; J and I, The inflection point in the change of O-P;Ma, mash wetlands; Ml, mash meadow wetlands; Me, meadow;similarly for the following figures.

圖2 不同水分梯度濕地小葉章葉片的Fo和FmFigure 2 Fo and Fm of Deyeuxia angustifolia leaves under different water gradients不同大小寫字母分別表示差異極顯著 (P＜0.01)和顯著 (P＜0.05)。下同。Different capital and lowercase letters indicate significant difference at 0.01 and 0.05 level, respectively；similarly for the following figures.

2.3 不同水分梯度下濕地小葉章葉片的標準化O-P、O-J和O-K曲線

分別將不同水分梯度小葉章葉片的OJIP曲線上O點相對熒光強度定義為0，P、J和K點相對熒光強度定義為1，把原始OJIP曲線按O-P、O-J和O-K標準化后可以看出(圖4)，標準化O-P曲線上J點和I點相對可變熒光(VJ和VI)、標準化O-J曲線上K點相對可變熒光(VK)和標準化O-K曲線上L點相對可變熒光(VL)均出現(xiàn)明顯的差異，通過△VO-P、△VO-J和△VO-K也可以看出，沼澤化草甸和草甸小葉章葉片VJ、VK和VL均明顯低于沼澤。

圖3 不同水分梯度濕地小葉章葉片的 Fv / Fm 和 PIABSFigure 3 Fv / Fm and PIABS of Deyeuxia angustifolia leaves under different water gradients

圖4 不同水分梯度濕地小葉章葉片的標準化O-P、O-J和O-K曲線及其差值Figure 4 O-P, O-J and O-K curve of Deyeuxia angustifolia leaves under different water gradients

2.4 不同水分梯度下濕地小葉章葉片 J、K 和L點相對可變熒光

定量分析標準化O-P、O-J和O-K曲線上各特征點的相對可變熒光(VJ、VK和VL)變化可以看出(圖5)，濕地水分含量的降低均明顯導致了小葉章葉片VJ、VK和VL的降低，但其降低幅度不同。與沼澤相比，草甸小葉章葉片VJ、VK和VL的降低幅度稍大于沼澤化草甸，但二者間差異均未達顯著水平(P ＞ 0.05)。雖然沼澤化草甸小葉章葉片的VJ和VK與沼澤之間差異均不顯著(P ＞ 0.05)，但草甸小葉章葉片的VJ和VK卻均顯著低于沼澤小葉章(P＜0.05)。另外，沼澤化草甸和草甸小葉章葉片的VL分別低于沼澤小葉章10.58%和13.41%，均差異顯著 (P＜0.05)。

圖5 不同水分梯度濕地小葉章葉片的VJ、VK和VLFigure 5 VJ, VK and VL of Deyeuxia angustifolia leaves under different water gradients

2.5 不同水分梯度下濕地小葉章葉片葉綠素熒光參數(shù)的光響應曲線

隨著光照強度的增加，小葉章葉片的實際光化學效率ФPSⅡ呈降低趨勢（圖6），而電子傳遞速率ETR則呈先增加后降低趨勢。不同水分梯度下小葉章葉片的ФPSⅡ和ETR卻明顯不同，在光照強度為 100 和 200 μmol·(m2·s)-1時，3 個水分梯度下小葉章葉片的ФPSⅡ和 ETR 均無顯著差異 (P ＞ 0.05)，但隨著光照強度的進一步增加，沼澤小葉章葉片的ФPSⅡ降低幅度以及ETR的增加幅度均低于沼澤化草甸和草甸小葉章，而沼澤化草甸小葉章葉片的ФPSⅡ和ETR雖也稍低于草甸小葉章，但二者差異水平較小。

2.6 不同水分梯度濕地小葉章葉片 PSII 反應中心能量分配參數(shù)

不同水分梯度下小葉章葉片PSII反應中心吸收光能的分配參數(shù)(Ф)明顯不同(圖7)。與沼澤相比，當水分含量降低后，沼澤化草甸和草甸小葉章葉片的ФPSⅡ分別增加了5.49%和6.23%，而ФNPQ均沒有發(fā)生明顯變化，Фf,D和ФNF則有不同程度的降低。

圖6 不同水分梯度下濕地小葉章葉片葉綠素熒光參數(shù)的光響應曲線Figure 6 Chlorophyll fluorescence curve of Deyeuxia angustifolia leaves under different water gradients

3 討論

長期的淹水會抑制植物的生長，其原因主要是由于根系低氧環(huán)境造成根系活力降低引起其呼吸速率減慢，甚至造成無氧呼吸[26]，淹水還會影響植物的光合能力，造成植物葉片葉綠素含量的降低、氣孔關閉、光合能力降低等[27]。植物在淹水脅迫后會導致植物葉片細胞的超微結構受到傷害、其葉片中的光合酶活性和PSII反應中心活性將會降低[28-29]。但是由于水生植物根系的獨特結構，對淹水具有極強的適應能力。那么水生植物針對季節(jié)性淹水以及當水分退去后植物體自身的生理適應性會發(fā)生什么變化？特別是典型的濕地植物在濕地退化后是否具有對不同水分梯度的適應能力，是決定其能否成為建群種的關鍵。植物的光合能力是植物對環(huán)境影響較為敏感的生理過程之一，葉綠素熒光技術是研究植物光合機構特別是PSII功能的重要手段之一[30]。本研究中通過利用快相葉綠素熒光動力學技術研究了三江平原濕地典型植被小葉章PSII功能對不同水分梯度的影響，結果發(fā)現(xiàn)，與長期淹水沼澤小葉章相比，季節(jié)性淹水的沼澤化草甸和地表無淹水的草甸小葉章葉片F(xiàn)v/ Fm和 PIABS均有不同程度的增加，F(xiàn)v/ Fm和 PIABS均為反映植物PSII光化學活性的重要指標，說明沼澤化草甸和草甸小葉章葉片的PSII光化學活性均較處于長期淹水條件下的小葉章有所增加，這可能是由于較低的土壤水分或淹水非淹水交替作用下小葉章根系獲得充足的O2供應有關，另外，草甸小葉章葉片的Fv/ Fm和PIABS均稍高于沼澤化草甸小葉章，這進一步驗證了在土壤供氧量增加時，更有利于小葉章葉片的光合功能增強。為進一步分析不同水分梯度條件下小葉章葉片具有不同PSII光化學活性的原因，將不同處理下小葉章葉片的OJIP分別進行了標準化，并且分析了標準化曲線上各特征點的相對可變熒光變化，結果發(fā)現(xiàn)，與沼澤小葉章相比，沼澤化草甸和草甸小葉章葉片標準化O-P、O-J和O-K曲線上各特征點的相對可變熒光VJ、VK和VL均明顯降低，特別是草甸小葉章葉片VJ、VK和VL降低更為明顯。標準化O-P曲線上2 ms處J點相對可變熒光VJ可以反映QA

-的積累量，即VJ的增強說明PSII受體側QA到QB的電子傳遞受阻[31-32]，標準化O-J曲線上0.3 ms處K點得出相對可變熒光VK的增加被認為是PSII電子供體側放氧復合體OEC活性受到傷害的重要標志[33]，標準化O-K曲線上0.15 ms處L點相對可變熒光VL的增加被認為是類囊體膜受到破壞的重要標志。因此，與長期淹水的沼澤小葉章相比，沼澤化草甸和草甸水分降低后小葉章葉片PSII受體側的電子傳遞速率和供體側的放氧復合體OEC的活性均有不同程度的增加，并且相對提高了小葉章葉片的類囊體膜的穩(wěn)定性，這均是導致其PSII光化學活性有所增加的重要原因。小葉章光合PSII功能的增強，對維持葉片的正常光合碳同化能力，促進小葉章的生長具有重要的意義，這與王麗等[18]的研究發(fā)現(xiàn)無常年積水小葉章群落生物量大于常年積水群落的結果相吻合。

圖7 不同水分梯度濕地小葉章葉片PSII反應中心能量分配參數(shù)Figure 7 PSⅡenergy allocation pathways in leaves of Deyeuxia angustifolia leaves under different water gradientsФPSⅡ，光化學反應的量子產額；ФNPQ，依賴于類囊體膜兩側質子梯度和葉黃素循環(huán)的量子產額；Фf, D，基本的熒光量子產額和熱耗散的量子產額；ФNF，失活 PSII 反應中心的熱耗散量子產額。ФPSⅡ, the amount of photochemical reactionQuantum yield；ФNPQ, depends on the thylakoid membranes and on both sides of the proton gradient; Фf, D,The quantum yield of lutein circulation and a basic load of fluorescent zi chan Quantum yield of heat dissipation; ФNF, the deactivation PSII reactionThe heat dissipation quantum yield of the center.

葉綠素熒光參數(shù)ФPSⅡ和ETR的光響應曲線可以用來分析植物對光強的利用能力[34]。雖然在100 和 200 μmol·(m2·s)-1時，3 個水分梯度下小葉章葉片的ФPSⅡ和ETR均無顯著差異，但隨著光照強度的進一步增加，沼澤小葉章葉片的ФPSⅡ降低幅度以及ETR的增加幅度均明顯低于沼澤化草甸和草甸小葉章，而沼澤化草甸小葉章葉片的ФPSⅡ和ETR雖也稍低于草甸小葉章，但二者差異水平較小。這說明與長期淹水狀態(tài)下的沼澤小葉章相比，沼澤化草甸和草甸小葉章葉片的光能利用能力增強，特別是對高光強的利用能力更明顯高于沼澤小葉章。另外，通過對PSII反應中心吸收光能分配去向的研究結果也可以發(fā)現(xiàn)，與沼澤小葉章相比，當土壤水分含量降低后，沼澤化草甸和草甸小葉章葉片的ФPSⅡ均明顯增加，說明與長期淹水狀態(tài)下沼澤小葉章相比，沼澤化草甸和草甸小葉章葉片吸收光能用于光化學反應的比例較高，這對于維持正常的光合電子傳遞，保證同化力(NADPH和ATP)的供應起到了積極作用。與長期淹水沼澤小葉章相比，沼澤化草甸和草甸小葉章葉片的ФNPQ均沒有發(fā)生明顯變化，但Фf,D和ФNF則有不同程度的降低，這說明與長期淹水狀態(tài)下小葉章相比，土壤含水量降低時小葉章葉片激發(fā)能以無效熱能形式耗散的比例降低，并且分配到失活反應中心的能比例也有所降低，這對于維持小葉章葉片的正常光合電傳遞能量供應發(fā)揮了重要的作用。

4 結論

與長期淹水狀態(tài)下沼澤小葉章相比，濕地土壤水分退去后，沼澤化草甸和草甸小葉章葉片的PSII功能均有不同程度地提高，主要表現(xiàn)為PSII光化學效率增加，PSII供體側放氧復合體OEC的活性及PSII受體側的電子傳遞能力均有所提高，對光能的利用能力特別是對強光的利用能力增強，光能利用及分配情況優(yōu)化，這可能是導致沼澤化草甸及草甸濕地類型中小葉章成為優(yōu)勢種的重要原因之一。但沼澤化草甸和草甸小葉章葉片的PSII功能差異較小。