王日明，王志強(qiáng)，向佐湘

（1. 北部灣大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，廣西 欽州 535011；2. 湖南芷蘭生態(tài)環(huán)境建設(shè)有限公司, 湖南 長(zhǎng)沙 410000；3. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院草業(yè)科學(xué)系, 湖南 長(zhǎng)沙 410128）

草坪在現(xiàn)代城市發(fā)展和日常生活中起著越來越重要的作用。南方亞熱帶過渡區(qū)6-8月份氣溫常達(dá)35～38 ℃, 而對(duì)于大多數(shù)的冷季型草坪草來說，在夏季高溫條件下普遍難以越夏。多年生黑麥草(Lolium perenne)是城市和庭園綠化以及足球場(chǎng)運(yùn)動(dòng)草坪建植中常用的冷季型草種，因其具有草坪質(zhì)量?jī)?yōu)異、分蘗性能好、成坪迅速等優(yōu)點(diǎn)，常被作為草坪建植的先鋒草種。黑麥草的最適生長(zhǎng)溫度范圍為15～25 ℃，高于35 ℃時(shí)植株的生長(zhǎng)發(fā)育不良，草坪質(zhì)量下降甚至植株死亡[1-2]。

溫度過高通常會(huì)傷害植物的細(xì)胞膜，進(jìn)而影響植物的正常生長(zhǎng)發(fā)育。高溫脅迫下植物體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量的超氧陰離子 (superoxide anion, O2·ˉ)、單線態(tài)氧 (singlet oxygen,1O2) 以及過氧化氫 (hydrogen peroxide, H2O2)等 活 性 氧 (reactive oxygen species,ROS)[3]。但由于植物體內(nèi)同時(shí)具有相應(yīng)的ROS清除系統(tǒng)，使得ROS的產(chǎn)生和消除處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。當(dāng)ROS含量到達(dá)一定程度或出現(xiàn)過剩時(shí)，破壞細(xì)胞內(nèi)的大分子結(jié)構(gòu)，造成細(xì)胞膜出現(xiàn)膜脂過氧化，導(dǎo)致植物代謝失調(diào)、光合降低等變化。在植物的細(xì)胞體內(nèi)存在由酶促抗氧化和非酶促抗氧化反應(yīng)組成的兩套R(shí)OS清除系統(tǒng)，酶促抗氧化主要 有 超 氧 化 物 歧 化 酶 (superoxide dismutase, SOD)、過氧化氫酶(catalase, CAT)、抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase, APX)及過氧化物酶 (Peroxidase,POD)等，高溫脅迫常誘導(dǎo)這些抗氧化酶大量合成和活性提高[4]。因此，SOD、POD、CAT和APX等抗氧化酶活性的高低常作為植物耐高溫能力的判定指標(biāo)之一。

γ-氨基丁酸(GABA)是在動(dòng)植物體內(nèi)普遍存在的四碳非蛋白類氨基酸。GABA可以作為外源小分子物質(zhì)參與到植物的生長(zhǎng)發(fā)育和逆境脅迫調(diào)控等一系列的生理代謝途徑[5]。當(dāng)植物受到水分、溫度、鹽堿等一些逆境脅迫時(shí)，植物體內(nèi)GABA的含量大量增加而抗逆性提高[6]。外源GABA可作為臨時(shí)氮庫，通過清除活性氧自由基[7-8]、調(diào)節(jié)pH和滲透調(diào)節(jié)等作用減緩逆境脅迫對(duì)植株的傷害[9]。外源GABA能夠增強(qiáng)番茄(Lycopersicon esculentum)[10-11]、網(wǎng)紋甜瓜(Cucumis melo)[7]、黃瓜(Cucumis sativus)[12-13]、小麥 (Triticum aestivum)[14]、玉米 (Zea mays)[15]、白三葉(Trifolium repens)[16]、等植物在干旱、鹽害、冷害、缺氧、淹水等逆境脅迫中的抗性。但是關(guān)于外源GABA能否提高多年生黑麥草的耐熱性，尤其是在高溫脅迫下外源GABA對(duì)黑麥草的抗氧化防御系統(tǒng)及內(nèi)源激素代謝的影響未見報(bào)道。因此，本研究在前期試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以耐熱性弱的黑麥草品種為材料，研究外源GABA對(duì)高溫脅迫下黑麥草的生長(zhǎng)和草坪質(zhì)量、葉綠素含量、根系活力、ROS代謝、抗氧化酶的活性及其基因的表達(dá)和內(nèi)源激素代謝的影響，探討外源GABA影響多年生黑麥草抗熱性的生理機(jī)制，為進(jìn)一步研究外源GABA增強(qiáng)植物抗逆能力奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

本研究以耐熱性弱的多年生黑麥草品種‘頂峰'(Pinnacle)為試驗(yàn)材料[17]。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與處理

將黑麥草種子播種于塑料花盆中，花盆的尺寸為上口徑 15 cm、下口徑 10 cm、高 15 cm，栽培基質(zhì)為體積比1∶1混合均勻的市售花卉培養(yǎng)基質(zhì)和河砂，放置于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)科研試驗(yàn)溫室中培養(yǎng)。待發(fā)芽后苗高約8 cm時(shí)開始修剪，修剪高度保持在6 cm左右，每周每盆澆Hoagland's營(yíng)養(yǎng)液 200 mL。

播種好的花盆放置于溫室中培養(yǎng)約45 d，然后將各盆栽材料轉(zhuǎn)入生長(zhǎng)箱內(nèi)預(yù)培養(yǎng)3 d，培養(yǎng)條件為溫度 25 ℃/20 ℃(晝/夜)，相對(duì)濕度 65%～75%，光周期 12 h，光合有效輻射 400 μmol·(m2·s)-1。盆栽材料在生長(zhǎng)箱預(yù)培養(yǎng)3 d后開始進(jìn)行試驗(yàn)處理，每盆噴施GABA溶液100 mL并同時(shí)澆灌150 mL 0、2.5、5、10 和 20 mmol·L-1的 GABA 溶液，上述步驟2 d后開始進(jìn)行溫度處理，一個(gè)生長(zhǎng)箱晝夜溫度設(shè)為25 ℃/20 ℃(常溫)，另一個(gè)生長(zhǎng)箱晝夜溫度設(shè)為 35 ℃/30 ℃(高溫)；共處理 7 d，待篩選出最佳GABA濃度后重復(fù)上述試驗(yàn)步驟進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定，試驗(yàn)共設(shè)4個(gè)處理(對(duì)照、常溫+GABA、高溫、高溫+GABA)，每個(gè)處理設(shè)4次重復(fù)(4盆)，完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)。各處理盆栽材料每天澆水保持土壤體積含水量為30%～32%，防止干旱。在高溫處理后的7、14和21 d取樣進(jìn)行測(cè)定分析。每盆取倒數(shù)第3～5片功能葉片剪成約1 cm長(zhǎng)的小段后混勻，在液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱備用。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1)生長(zhǎng)速率：試驗(yàn)處理前將冠層修剪整齊并測(cè)定高度，然后在處理的7、14和21 d用直尺測(cè)定各處理的冠層高度，兩者之差再除以處理天數(shù)為生長(zhǎng)速率，單位為cm·d-1。

2)草坪質(zhì)量：采用目測(cè)法，根據(jù)草坪的色澤、密度、質(zhì)量和均一性進(jìn)打分評(píng)價(jià)(0～9分)。

3)電導(dǎo)率：取約0.1 g葉片，用去離子水沖洗干凈，剪成1 cm的小段置于試管中，加去離子水10 mL后在室溫條件下，轉(zhuǎn)速 200 r·min-1，振蕩 24 h 后，測(cè)外滲液的電導(dǎo)率(E1)，然后封口在高壓滅菌鍋中高溫高壓滅菌15 min，冷卻至室溫后測(cè)電導(dǎo)率(E2)，再按下式計(jì)算：相對(duì)電導(dǎo)率 = [E1/E2] × 100%。

4)葉綠素含量：樣品經(jīng)二甲基亞砜浸提后，采用分光光度計(jì)法測(cè)定[18]。

5)根系活力測(cè)定：根據(jù)TTC還原法進(jìn)行測(cè)定[19]。

6)活性氧和抗氧化酶活性測(cè)定：采用pH 7.8的磷 酸 緩 沖 液 (phosphate buffer solution, PBS)提 取 酶液。根據(jù)Hu等[20]的方法，用硫酸鈦法測(cè)定H2O2含量，羥胺氧化反應(yīng)法測(cè)定O2·ˉ產(chǎn)生速率，氮藍(lán)四唑氧光化還原法測(cè)定超氧化物歧化酶活性，愈創(chuàng)木酚法測(cè)定過氧化物酶活性，過氧化氫還原法測(cè)定過氧化氫酶活性，紫外吸收法測(cè)定抗壞血酸過氧化物酶活性。

7)內(nèi)源激素：根據(jù)王日明和熊興耀[17]的方法，采用高效液相色譜質(zhì)譜(HPLC-MS)的方法測(cè)定ABA、IAA、GA3和ZR含量。樣品的內(nèi)源激素含量用外標(biāo)法，激素含量由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到。

8)抗氧化酶基因表達(dá)分析：采用Trizol試劑盒提取黑麥草葉片總RNA，用Nanodrop 2000檢測(cè)濃度和純度，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)完整性。根據(jù) Fermentas cDNA synthesis試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。參考TaKaRa公司的SYBR System操作手冊(cè)，采用ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性 5 s，52～55 ℃ 退火 20 s，40 個(gè)循環(huán)。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。基因特異性引物為F/R，以eEF1A(s)基因?yàn)閮?nèi)參，序列參考Hu等[21]進(jìn)行合成(表1)。根據(jù)得到的Ct值，利用2-△△CT法，分別計(jì)算目標(biāo)基因在不同處理下的相對(duì)表達(dá)量[22]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

利用 SAS for Window 9.0 軟件對(duì)試驗(yàn)中的生長(zhǎng)速率、草坪質(zhì)量、電導(dǎo)率、葉綠素含量、活性氧、抗氧化酶活性、激素含量等數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，采用Duncan多重比較檢驗(yàn)不同處理間的差異顯著性 (P＜0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源GABA對(duì)高溫脅迫下黑麥草生長(zhǎng)和草坪質(zhì)量的影響

正常生長(zhǎng)條件下不同濃度外源GABA處理對(duì)黑麥草的生長(zhǎng)速率和草坪質(zhì)量無顯著影響(P ＞ 0.05)(圖1)。高溫脅迫顯著降低了黑麥草的生長(zhǎng)速率和草坪質(zhì)量(P＜0.05)，但外源施用GABA后不同程度地緩解了因高溫脅迫而造成黑麥草生長(zhǎng)速率和草坪質(zhì)量的下降，尤其當(dāng)GABA濃度為5和10 mmol·L-1時(shí)與未施用GABA處理相比，顯著提高了生長(zhǎng)速率和草坪質(zhì)量。

表1 試驗(yàn)中所用基因及其引物序列Table 1 Genes and primers used in the experiment

2.2 外源GABA處理對(duì)高溫脅迫下黑麥草耐熱性相關(guān)生理指標(biāo)的影響

2.2.1 對(duì)葉片細(xì)胞膜穩(wěn)定性的影響

高溫脅迫下黑麥草葉片的相對(duì)電導(dǎo)率隨著高溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著升高(P＜0.05)(圖2)，在脅迫處理 7、14和 21 d，電導(dǎo)率顯著高于對(duì)照 (P＜0.05)，分別比對(duì)照增加了1.6、3.4和5.4倍；施用外源GABA后，黑麥草葉片電導(dǎo)率雖然隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，在脅迫處理7、14和21 d分別是對(duì)照的1.2、2.1和3.9倍，但與高溫處理下未施用GABA的處理相比顯著降低。

2.2.2 對(duì)葉綠素含量的影響

高溫脅迫下黑麥草葉片的葉綠素含量呈顯著下降趨勢(shì)，在高溫脅迫的7、14和21 d，葉綠素含量均較對(duì)照顯著下降(P＜0.05)，分別比對(duì)照下降了84%、63%和43%(圖3)；外源施用GABA后則顯著緩解了因高溫而造成的葉綠素含量的下降，在高溫處理后的7、14和21 d，葉綠素含量分別下降至對(duì)照的95%(P ＞ 0.05)、80%(P＜0.05)和 63%(P＜0.05)，在高溫脅迫下外源施用了GABA的處理葉綠素含量顯著高于未施用GABA處理。

2.2.3 對(duì)根系活力的影響

高溫脅迫下黑麥草的根系活力隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著下降(P＜0.05)，在脅迫處理的7、14和21 d分別下降至對(duì)照的81%、59%和36%(圖4)；但是外源施用GABA后，黑麥草的根系活力下降程度顯著得到緩解，在脅迫處理的7、14和21 d分別下降至正常對(duì)照的 91%(P ＞ 0.05)、75%(P＜0.05)和54%(P＜0.05)，在高溫脅迫下外源施用了GABA的處理根系活力顯著高于未施用GABA的處理。

2.2.4 對(duì)活性氧代謝的影響

高溫脅迫下黑麥草植株內(nèi)的活性氧超氧陰離子產(chǎn)生速率和過氧化氫含量均隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著上升 (P＜0.05)(圖 5)。在高溫處理的7、14 和 21 d，O2·ˉ的產(chǎn)生速率分別為對(duì)照的 1.1、1.46和1.52倍，H2O2含量分別為對(duì)照的1.8、3.4和4.7倍。高溫脅迫下外源施用GABA后，黑麥草體內(nèi)的O2·ˉ的產(chǎn)生速率和H2O2含量均顯著低于未施用GABA的處理，表現(xiàn)為在高溫處理的7、14 和 21 d，O2·ˉ的產(chǎn)生速率分別為對(duì)照的 1.08、1.2和1.3倍，H2O2含量分別為對(duì)照的1.5、2.6和3.9倍。

圖1 外源GABA對(duì)高溫脅迫下黑麥草生長(zhǎng)速率和草坪質(zhì)量的影響Figure 1 Effect of exogenous GABA on the growth rate and turf quality of perennial ryegrass under heat stress同一溫度不同小寫字母表示不同濃度處理間差異顯著(P＜0.05)Different lowercase letters within same temperature indicate significant difference among different concentration treatments at the 0.05 level.

圖2 外源GABA對(duì)高溫脅迫下黑麥草葉片電導(dǎo)率的影響Figure 2 Effect of exogenous GABA on the leaf electrolyte leakage in perennial ryegrass under heat stress不同小寫字母表示同一處理不同處理時(shí)間間差異顯著(P ＜0.05)，不同大寫字母表示同一處理時(shí)間不同處理間差異顯著(P ＜0.05)。 下同。Different lowercase letters within same treatment indicate significant difference between different treatment duratuions at the 0.05 level, and different capital letters indicate significant difference between different treatments in the same duration; similarly for the following figures.

圖3 外源GABA對(duì)高溫脅迫下黑麥草葉綠素含量的影響Figure 3 Effect of exogenous GABA on the leaf chlorophyll content in perennial ryegrass under heat stress

2.2.5 對(duì)葉片抗氧化酶活性的影響

在高溫脅迫下黑麥草葉片的SOD、POD、CAT和APX活性表現(xiàn)為先升高后下降的趨勢(shì)(圖6)；在脅迫處理7和14 d，4種抗氧化酶的活性均顯著高于對(duì)照 (P＜0.05)，隨后在脅迫處理 21 d 時(shí) 4 種抗氧化酶活性與對(duì)照差異不顯著(P ＞ 0.05)。高溫脅迫下外源施用GABA顯著提高了黑麥草葉片SOD、POD、CAT和APX活性，在脅迫處理7 d時(shí)，施用GABA處理比未施用GABA處理分別提高了29%、21%、22%和16%，脅迫處理14 d分別提高了22%、24%、34%和13%，尤其是在脅迫處理21 d時(shí)，分別提高了113%、67%、37%和21%。

2.3 外源GABA對(duì)高溫脅迫下黑麥草葉片激素代謝的影響

高溫脅迫促進(jìn)了黑麥草葉片ABA的積累，并且隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)積累量顯著升高(P＜0.05)(表2)，在高溫迫處理7、14和21 d時(shí)，ABA含量分別升高至對(duì)照的2.2、3.6和6.6倍。常溫條件下外源施用GABA對(duì)黑麥草葉片的ABA含量較對(duì)照無顯著影響(P ＞ 0.05)；高溫脅迫條件下外源施用GABA較對(duì)照顯著促進(jìn)了黑麥草葉片ABA的積累和含量的增加，在脅迫處理7、14和21 d時(shí)，ABA含量分別升高至對(duì)照的4.3、5.5和9.7倍。

高溫脅迫處理下，黑麥草葉片中的IAA、GA3和ZR的含量均隨著脅迫處理時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著下降 (P＜0.05)(表 2)；在高溫處理 7、14 和 21 d，IAA含量分別下降至對(duì)照的78%、69%和49%，GA3含量分別下降至對(duì)照的67%、35%和12%，ZR含量分別下降至對(duì)照的64%、43%和30%。常溫條件下外源施用GABA對(duì)黑麥草葉片的IAA、GA3和ZR含量無顯著影響(P ＞ 0.05)；高溫處理下外源施用GABA顯著緩解了因高溫脅迫而造成的黑麥草葉片IAA、GA3和ZR含量的下降；在高溫處理7、14和 21 d、IAA含量?jī)H分別下降至對(duì)照的89%、76%和62%，GA3含量分別下降至對(duì)照的85%、54%和27%，ZR含量分別下降至對(duì)照的74%、55%和44%。

圖4 外源GABA對(duì)高溫脅迫下黑麥草根系活力的影響Figure 4 Effect of exogenous GABA on the root activity in perennial ryegrass under heat stress

圖5 外源GABA對(duì)高溫脅迫下黑麥草超氧陰離子(O2·ˉ)產(chǎn)生速率和過氧化氫(H2O2)含量的影響Figure 5 Effect of exogenous GABA on the O2·ˉ and H2O2 content in perennial ryegrass under heat stress

2.4 外源GABA對(duì)高溫脅迫下黑麥草抗氧化酶基因表達(dá)的影響

高溫脅迫下抗氧化酶APX和POD基因(圖7A、圖7C)的表達(dá)水平在處理7 d時(shí)上調(diào)表達(dá)，在脅迫14 d時(shí)與對(duì)照無顯著差異 (P ＞ 0.05)，隨后在處理 21 d時(shí)表達(dá)量顯著下調(diào)(P＜0.05)，而CAT基因(圖7B)的表達(dá)水平在高溫脅迫下隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)呈下調(diào)表達(dá)趨勢(shì)。在常溫生長(zhǎng)條件下，外源施用GABA對(duì)APX、POD和CAT基因的表達(dá)水平?jīng)]有顯著影響；但在高溫脅迫條件下，與未施用GABA的處理相比，外源施用GABA顯著誘導(dǎo)了黑麥草葉片APX、POD和CAT基因的表達(dá)，在處理的7 d，分別提高了23%、17%和16%，在處理的14 d，分別提高了39%、28%和43%，在處理的21 d，分別提高了66%、37%和40%。

高溫脅迫誘導(dǎo)了SOD基因的上調(diào)表達(dá)，但不同SOD基因的表達(dá)模式不一樣。與對(duì)照相比，在高溫脅迫處理的 7 和 14 d，Cu/ZnSOD(圖 7D)，MnSOD(圖7E)和FeSOD(圖7F)基因均顯著上調(diào)表達(dá)，在脅迫處理的21 d僅MnSOD基因上調(diào)表達(dá)，而Cu/ZnSOD和FeSOD基因則下調(diào)表達(dá)。常溫生長(zhǎng)條件下外源施用GABA對(duì)黑麥草葉片的SOD基因的表達(dá)水平?jīng)]有顯著影響，但在高溫脅迫下外源施用GABA則誘導(dǎo)了抗氧化酶基因的上調(diào)表達(dá)；與高溫條件下未施用GABA的處理相比，在脅迫處理的7、14和21 d，Cu/ZnSOD基因的表達(dá)分別上調(diào)了6%、16%和35%，MnSOD基因的表達(dá)分別上調(diào)了18%、20%和5%，F(xiàn)eSOD基因的表達(dá)分別上調(diào)了12%、18%和42%。

圖6 外源GABA對(duì)高溫脅迫下黑麥草葉片超氧化物岐化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)和抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性的影響Figure 6 Effect of exogenous GABA on the SOD, POD, CAT and APX activity in leaves of perennial ryegrass under heat stress

3 討論

3.1 外源GABA提高了黑麥草的耐高溫能力

高溫常造成冷季型草坪草生長(zhǎng)發(fā)育受阻、草坪質(zhì)量下降、細(xì)胞膜透性增大和膜脂過氧化程度增加、葉片枯黃衰老、根系活力下降等生理生化變化[23]。前人研究發(fā)現(xiàn)，用外源GABA對(duì)番茄[10]、小麥[24]種子進(jìn)行浸泡可以有效增加發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)。同時(shí)，還有研究發(fā)現(xiàn)，外源GABA可提高黃瓜[16]、番茄[11]、玉米[14]對(duì)鹽脅迫和漬水脅迫的抵抗能力。本研究結(jié)果顯示，外源施用GABA對(duì)高溫脅迫下黑麥草的生長(zhǎng)速率、草坪質(zhì)量、細(xì)胞膜透性和根系活力的下降均具有很好的緩解作用，這表明外源GABA對(duì)黑麥草在高溫脅迫下生長(zhǎng)的抑制具有緩解作用，施用外源GABA可以顯著提高黑麥草的耐高溫能力，這與在冷季型草坪草匍匐剪股穎(Agrostis stolonifera)中的研究結(jié)果相一致[25-26]。

3.2 外源GABA延緩了高溫脅迫下黑麥草植株的衰老

本研究結(jié)果顯示，高溫脅迫下黑麥草葉片枯黃失綠和根系活力下降，表明高溫脅迫導(dǎo)致了黑麥草植株的衰老，葉綠體結(jié)構(gòu)和根系吸收能力受到破壞，這與前人在高羊茅(Festuca arundinacea)[27]、剪股穎[28]、仙客來(Cyclamen persicum)[29]、玉米[30]、小麥[31]和水稻(Oryza sativar)[32]的研究結(jié)果相一致。高溫脅迫下施用外源GABA顯著提高了黑麥草的葉綠素含量和根系活力，表明外源GABA緩解了高溫對(duì)黑麥草葉片和根系的傷害，延緩了植株葉片和根系的衰老，從而有利于維持葉片的光合能力和根系的吸收能力，提高了耐高溫能力。

3.3 外源GABA提高了高溫脅迫下黑麥草的抗氧化能力

本研究結(jié)果顯示，高溫脅迫下黑麥草體內(nèi)的ROS產(chǎn)生速率和含量以及電導(dǎo)率顯著升高，并且隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而加劇，表明高溫脅迫下黑麥草植株細(xì)胞內(nèi)受到了氧化傷害。王曉冬等[14,33]研究表明GABA可通過調(diào)節(jié)抗氧化酶系統(tǒng)來增強(qiáng)小麥的耐熱性和耐澇性；楊麗文等[34]研究認(rèn)為，低氧脅迫下外源GABA能顯著提高甜瓜( Cucumis melo)幼苗葉片SOD、CAT、APX、GR等抗氧化酶的活性。高溫條件下施用外源GABA后，黑麥草葉片內(nèi)的SOD、POD、CAT和APX基因的表達(dá)水平顯著上調(diào)，同時(shí)SOD、POD、CAT和APX活性也顯著升高，O2·ˉ和H2O2等ROS水平顯著降低，表明高溫下施用GABA可誘導(dǎo)抗氧化酶基因的上調(diào)表達(dá)，從而提高多個(gè)高抗氧化酶活性共同組成體內(nèi)的保護(hù)酶系統(tǒng)來清除體內(nèi)過量的ROS，促進(jìn)黑麥草細(xì)胞胞內(nèi)ROS代謝平衡，提升細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，從而緩解高溫脅迫對(duì)植株造成的傷害，增強(qiáng)黑麥草的耐熱性。

表2 外源GABA對(duì)高溫脅迫下黑麥草葉片內(nèi)源激素含量的影響Table 2 Effect of exogenous GABA on endogenous hormones content in the leaves of perennial ryegrass under high temperature stressng·g-1

3.4 外源GABA提高了高溫脅迫下黑麥草的激素代謝水平

植物對(duì)外界環(huán)境的抵抗能力常受植株內(nèi)源激素的調(diào)控，與植物對(duì)環(huán)境脅迫的適應(yīng)性密切相關(guān)[35]。本研究前期[16]及本研究結(jié)果均表明，在高溫處理下黑麥草葉片ABA含量均隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著提高，而GA3、IAA和ZR含量均隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著降低，這與前人的研究[36-37]結(jié)果一致。高溫脅迫下維持較高的內(nèi)源激素水平，不僅可以誘導(dǎo)或增加抗性基因的表達(dá)而增強(qiáng)植物對(duì)高溫的適應(yīng)能力，還可以提高SOD等膜保護(hù)酶的活性，直接或間接地清除自由基，減輕因逆境脅迫產(chǎn)生的氧自由基對(duì)細(xì)胞膜系統(tǒng)造成的傷害和延緩逆境脅迫下葉片的衰老，從而提高了黑麥草的耐高溫能力。

圖7 外源GABA對(duì)高溫脅迫下黑麥草葉片抗氧化酶基因表達(dá)的影響Figure 7 Effect of exogenous GABA on the expression level of antioxidant enzyme genes in the leaves of perennial ryegrass under heat stress

4 結(jié)論

通過在高溫條件下外源施用GABA對(duì)多年生黑麥草的生長(zhǎng)和草坪質(zhì)量, 細(xì)胞膜的穩(wěn)定性, 葉綠素含量, 根系活力, 活性氧水平, 抗氧化酶活性及其基因的表達(dá), 內(nèi)源激素ABA、GA3、IAA和ZR含量等指標(biāo)的測(cè)定分析表明，外源施用GABA能有效提高黑麥草的耐高溫能力，這與GABA誘導(dǎo)了抗氧化酶基因的上調(diào)表達(dá)，提高了抗氧化酶的活性從而有效清除和降低細(xì)胞內(nèi)的活性氧，減輕了由高溫脅迫造成的氧化傷害，穩(wěn)定了細(xì)胞膜系統(tǒng)密切相關(guān)；此外，高溫下施用GABA后植株內(nèi)維持較高的促進(jìn)生長(zhǎng)類激素IAA、GA3和ZR有助于緩解因高溫和呼吸增強(qiáng)導(dǎo)致的葉片枯黃衰老和根系活力的下降，進(jìn)而提高了黑麥草的抗高溫能力。