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        羊棲菜組分多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制作用

        2019-02-18 05:44:58丁浩淼夏彭奎王忠華汪財生陳海敏錢國英
        核農學報 2019年2期
        關鍵詞:糖苷酶底物組分

        丁浩淼 孫 弢 夏彭奎 湯 倩 王忠華 汪財生,? 陳海敏 錢國英

        (1寧波大學海洋學院,浙江 寧波 315211;2浙江萬里學院生物與環(huán)境學院,浙江 寧波 315100)

        糖尿病已成為人類的主要健康問題之一,其特征是慢性高血糖癥[1]。 目前,臨床上常用的口服降血糖藥物主要有雙胍類、硫脲類、噻唑烷二酮類、α-葡萄糖苷酶抑制劑和非磺脲類ATP 敏感性鉀通道抑制劑等[2-4]。 餐后高血糖是Ⅱ型糖尿病的重要癥狀之一[5],α-葡萄糖苷酶催化小腸內蔗糖、麥芽糖等寡糖的水解進而導致體內血糖升高[6]。 臨床上通常采用口服降血糖藥物抑制α-葡萄糖苷酶活性,代表性藥物有阿卡波糖(acarbose)、福格列波糖(voglibose)、米格列醇(miglitol)等,這些藥物對治療糖尿病有較好的療效,但會產生肝、腎損傷及消化道反應等副作用,且不能有效地控制并發(fā)癥。 故以α-葡萄糖苷酶為靶點,通過體外活性抑制試驗從海洋藻類篩選具有治療糖尿病的有效成分,已成為當下糖尿病治療藥物研究的熱點方向。

        羊棲菜(Sargassum fusiforme)為褐藻門馬尾藻科植物,廣泛分布于我國浙江、廣東、福建等淺海域,被譽為東亞“長壽蔬菜”[7]。 研究表明,羊棲菜多糖具有降血糖、降血脂、抗氧化及抗腫瘤等生物活性[8-9]。 于竹芹等[10]研究羊棲菜對四氧嘧啶糖尿病模型小鼠血糖水平的影響,發(fā)現(xiàn)羊棲菜可能通過增強超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)活性,降低體內脂質過氧化物丙二醛(malondialdehyde,MDA)和一氧化氮(NO)的水平,進而發(fā)揮調節(jié)血糖水平的作用。 張華芳[11]也曾以四氧嘧啶糖尿病小鼠為模型,研究羊棲菜粗多糖的降血糖模型,發(fā)現(xiàn)羊棲菜粗多糖能顯著降低糖尿病小鼠血糖水平,但對正常小鼠和糖尿病小鼠耐糖量無明顯改善。 張杰等[12]通過靜脈注射鏈脲佐菌素制作Ⅱ型糖尿病大鼠模型,發(fā)現(xiàn)羊棲菜粗多糖可能通過上調糖尿病大鼠胰島β 細胞中Glut-2 mRNA 表達,從而改善大鼠胰島素抵抗并降低血糖。 本研究在前期試驗的基礎上,以羊棲菜組分多糖為原料,以α-葡萄糖苷酶為靶標,研究羊棲菜多糖對α-葡萄糖苷酶抑制活性,并建立具有α-葡萄糖苷酶活性的Caco-2細胞模型,分析羊棲菜組分多糖對α-葡萄糖苷酶的作用,以期為羊棲菜組分多糖作為降血糖功能性食品原料開發(fā)及可持續(xù)利用提供一定的科學依據和理論基礎。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        羊棲菜購自浙江省溫州市洞頭縣浙江良泰水產有限公司,6月份新鮮藻體。

        α-葡萄糖苷酶、阿卡波糖、8-苯氨基-1-萘磺酸(8-anilinonaphthalene-1-sulfonic acid,ANS)、4-硝基苯- α-D - 吡 喃 葡 萄 糖 苷 ( 4-nitrophenyl - α-Dglucopyranoside, pNPG)、TritionX-100、四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)均購自美國Sigma公司;Caco-2 細胞由中科院上海細胞庫提供;DMEM-高糖培養(yǎng)基購自美國HyClone 公司;胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)購自美國Gibco 公司;氧化酶-葡萄糖試劑盒購自上海榮盛生物藥業(yè)有限公司;葡萄糖、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉、無水乙醇、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)等試劑均為分析純,購自國藥集團化學試劑有限公司。

        RC-200 中低壓全波長層析系統(tǒng),廣州睿伯科技有限公司;UV-2600 可見光分光光度計,日本島津公司;TLE104E 電子天平,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;Q2-861 微型旋轉混合儀,海門市其林貝爾儀器制造有限公司;Infinite 200 PRO 多功能酶標儀,帝肯(上海)貿易有限公司;ILB-008-04 低溫恒溫循環(huán)器,施都凱儀器設備(上海)有限公司。

        1.2 試驗方法

        前期試驗[13]篩選得到一種羊棲菜組分多糖(SFPSI),該SFPSⅠ經檢測不含蛋白質,多糖純度達95%以上,在紅外光譜中可見,754.6、842 cm-1是α-吡喃環(huán)的特征吸收,SFPSⅠ在1 250 cm-1處的峰增強,可能是有硫酸根S=O 的對癥伸縮振動。 SFPSⅠ具有糖類特征結構,且含有硫酸基功能基團[13]。 采用硫酸鋇比濁法發(fā)現(xiàn)SFPSⅠ的硫酸基含量為24.37%,高于其他組分。 本試驗著重研究SFPSⅠ對α-葡萄糖苷酶的抑制作用。

        1.3 羊棲菜組分多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制作用

        參考文獻[14-16]的方法。 在1 mL 磷酸鉀緩沖溶液配制的10 mmol·L-1pNPG 底物體系中,加入10 μL α-葡萄糖苷酶溶液,迅速混勻,應用可見光分光度計檢測400 nm 波長處每分鐘吸光值變化來指示反應速率值(ν),從而表征酶活力的大小。 測定溫度為37℃,所有樣品均用0.05 mol·L-1磷酸鉀緩沖溶液(pH值6.5)配制成濃度為0.2 ~1.0 mg·mL-1的樣液。 取10 μL 各濃度的阿卡波糖(陽性對照)、SFPSⅠ溶液與等體積的α-葡萄糖苷酶溶液混合,制成酶活體系,25℃保溫2 h 后測定其酶活力。 以體系中SFPSⅠ濃度為橫坐標,相對酶活力為縱坐標作圖。 相對酶活力=含相應濃度SFPSⅠ的α-葡萄糖苷酶液的酶活力/空白對照的酶活力×100%。

        1.4 羊棲菜組分多糖對α-葡萄糖苷酶活力抑制的抑制常數(shù)測定

        在反應體系中,加入不同濃度的SFPSⅠ,當?shù)孜飌NPG 濃度為10 mmol·L-1不變時,改變加入的酶量,測定酶催化底物氧化的活力隨酶量的關系。 在固定α-葡萄糖苷酶的濃度為1 μmol·L-1,改變底物pNPG 濃度的測活體系中,測定不同濃度抑制劑對酶活力的影響。 對于混合型抑制的一般分析,Lineweaver-Burk 的雙重倒數(shù)形式的方程可以寫為:

        斜率與抑制劑濃度的二級圖譜:

        繪制Y 軸截距與抑制濃度的二級圖譜:

        式中,ν:酶促反應速度,mmol·min-1;Km:米氏常數(shù),mol·L-1;[I]:抑制劑濃度,mg·mL-1;[S]:底物濃度,mmol·L-1;Ki:抑制常數(shù),μmol·L-1。 二次作圖時通過斜率(Slope)對[I]和Y 軸截距(Y- intercept)對[I]分別作圖,如果得到直線,說明具有單一的或一類抑制作用位點。

        1.5 α-葡萄糖苷酶內源熒光的測定

        參照文獻[17]的方法。 用50 mmol·L-1磷酸鹽緩沖溶液(pH 值6.9)配制不同濃度的SFPSⅠ溶液,取10 μL 各濃度的SFPSⅠ溶液分別與等體積的α-葡萄糖苷酶液混合,制成酶活體系且酶終濃度為1.0 μmol·L-1。25℃保溫2 h 后,用熒光分光光度計檢測內源熒光。 激發(fā)波長為280 nm,于300 ~400 nm 波長之間掃描樣品的熒光光譜。

        1.6 α-葡萄糖苷酶外源熒光測定

        參照文獻[18]的方法。 用50 mmol·L-1磷酸鹽緩沖溶液(pH 值6.9)配制不同濃度的SFPSⅠ溶液,取10 μL 各濃度的SFPSⅠ溶液分別與等體積的α-葡萄糖苷酶液混合,制成酶活體系且酶終濃度為1.5 μmol·L-1。25℃保溫2 h 后,加入ANS 至終濃度為42 μmol·L-1并置于暗處孵育40 min,用熒光光度計檢測外源熒光。 激發(fā)波長為390 nm,于400 ~600 nm 波長之間掃描樣品的熒光光譜。

        1.7 Caco-2 細胞培養(yǎng)

        參照文獻[19-21] 的方法并略作調整。 將Caco-2細胞接種于培養(yǎng)瓶(底面積25 cm2)中,加入5 mL DMEM培養(yǎng)基(含有10% FBS、1% L-谷氨酰胺、100 U·mL-1青霉素-鏈霉素雙抗液),置于37℃含5% CO2培養(yǎng)箱中,24 h 內貼壁培養(yǎng)。 待細胞生長至80%~90%時,棄去舊培養(yǎng)基,用Hank′s 平衡鹽溶液(Hank′s balanced salt solution, HBSS)沖洗2~3 次,加入2 mL 0.25%胰蛋白酶孵育90 s,然后添加含有血清的培養(yǎng)基終止消化,用吸管反復吹打形成單細胞懸液,并用細胞計數(shù)板計數(shù)。

        1.8 羊棲菜組分多糖的細胞毒性試驗

        參照文獻[22-24]的方法并略作調整。 采用MTT法,選擇SFPSⅠ對Caco-2 細胞的安全質量濃度,將細胞懸液稀釋為2×104個·mL-1,混勻后每孔100 μL 接種于96 孔板上,37℃、5% CO2環(huán)境中孵育24 h,棄去上清液,貼壁細胞用于試驗,每孔加入100 μL 含不同濃度(10、20、40、80 μg·mL-1)SFPSⅠ的完全培養(yǎng)基(陰性對照孔只加完全培養(yǎng)基),培養(yǎng)48 h 后檢查細胞增殖情況。 加入5 mg·mL-1MTT,每孔20 μL,置于37℃、5% CO2環(huán)境中孵育4 h,棄去上清液,每孔再加入DMSO 200 μL,避光震蕩15 min,采用多功能酶標儀在570 nm 波長處測定吸光度值。

        1.9 羊棲菜多糖對Caco-2 細胞模型的α-葡萄糖苷酶抑制作用

        參照文獻[25-27] 的方法并略作調整。 將人腸上皮細胞Caco-2 的細胞懸液稀釋為1×105個·mL-1并接種在24 孔板上。 進行試驗前棄去培養(yǎng)液,細胞用HBSS 潤洗3 次,除去細胞表面附著物。 加入25 mmol·L-1葡萄糖作為底物,陰性對照組中每孔加入800 μL 底物和200 μL HBSS,陽性對照組每孔加入800 μL 底物和200 μL 阿卡波糖,使阿卡波糖終濃度為25 μg·mL-1;試驗組每孔加入800 μL 底物和200 μL SFPSⅠ,使得SFPSI 終質量濃度分別為10、20、40、60、80 μg·mL-1;37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)40 min 后移至冰浴,迅速吸出50 μL 反應液,分別加入200 μL 的氧化酶-葡萄糖試劑工作液,于37℃反應30 min,在490 nm波長處測定吸光度值。 按照公式計算α-葡萄糖苷酶的抑制率:

        1.10 數(shù)據處理

        所有試驗均重復3 次,結果以平均值表示。 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據分析。

        2 結果與分析

        2.1 羊棲菜組分多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制作用

        測定時α-葡萄糖苷酶終濃度為1.0 μmol·L-1,底物pNPG 濃度為10 mmol·L-1。 由圖1 可知,當SFPSⅠ濃度為0.55 mg·mL-1時,α-葡萄糖苷酶的活性被完全抑制,酶活力下降一半時抑制劑濃度(IC50)為0.31 mg·mL-1,陽性對照組的IC50為0.32 mg·mL-1。 α-葡萄糖苷酶被不同濃度的SFPSⅠ孵育后,酶活性隨著SFPSⅠ濃度增加而降低,α-葡萄糖苷酶的活性以計量依賴的方式被抑制。

        圖1 SFPS I 對α-葡萄糖苷酶的抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of SFPSⅠon α-glucosidase

        2.2 羊棲菜組分多糖對α-葡萄糖苷酶的可逆抑制作用

        在反應體系中,當?shù)孜飌NPG 濃度不變時,加入不同濃度的SFPS Ⅰ和酶量,測定酶催化底物氧化的活力隨酶量的關系。 由圖2 可知,直線均經過坐標原點,直線的斜率隨著加入SFPS Ⅰ的濃度的增加而減小,表明SFPS Ⅰ對α-葡萄糖苷酶的抑制作用是一個可逆過程,抑制劑與酶蛋白以非共價鍵形式結合;SFPS Ⅰ抑制α-葡萄糖苷酶是通過抑制酶催化活性來降低其催化速率,而不是導致酶活性的不可逆喪失。

        2.3 羊棲菜組分多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制常數(shù)

        圖2 SFPS Ⅰ對α-葡萄糖苷酶活力的抑制作用Fig.2 The inhibitory effect of SFPS Ⅰon α-glucosidase

        固定α-葡萄糖苷酶的濃度為1 μmol·L-1,改變底物pNPG 濃度的測活體系中,發(fā)現(xiàn)不同濃度抑制劑對酶活力產生影響。 為判斷SFPSⅠ對α-葡萄糖苷酶的抑制類型,采用Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)作圖法,得到一組直線交于第二象限, SFPSⅠ對α-葡萄糖苷酶的抑制作用為混合型(圖3)。 通過斜率和Y 軸截距對[I]分別進行二次作圖,得到兩條直線(圖4、圖5),說明SFPSⅠ對α-葡萄糖苷酶具有單一的或者一類抑制作用位點,這與混合型抑制的機理相符。 SFPSⅠ與α-葡萄糖苷酶結合先形成酶-抑制劑復合物(EI),再與底物pNPG 接觸時形成EIS 復合物,從而降低或抑制了酶分子的催化能力。利用圖3 的數(shù)據和式(2)、(3)計算得到抑制劑的抑制常數(shù)Ki值為0.14 μmol·L-1,故推斷出SFPSⅠ與α-葡萄糖苷酶在酶活性中心部位或附近部位結合,誘導構象變化,進而導致Km和vmax的變化。

        圖3 Lineweave-Burk 雙倒數(shù)曲線圖Fig.3 Lineweave-Burk double inverse curve

        2.4 羊棲菜組分多糖作用于α-葡萄糖苷酶的內源熒光測定

        由圖6 可知,SFPS Ⅰ能猝滅α-葡萄糖苷酶的內源熒光,隨著與α-葡萄糖苷酶共保溫的SFPS Ⅰ濃度的升高,內源熒光強度逐漸降低。 由圖7 可知,熒光強度峰值處波長出現(xiàn)紅移現(xiàn)象,所以SFPS Ⅰ作用于α-葡萄糖苷酶時引起了酶三級結構的變化。 與圖1 相比,誘導α-葡萄糖苷酶結構變化所需的SFPS Ⅰ濃度與實現(xiàn)酶活性喪失所需的濃度非常相似,這表明SFPS Ⅰ誘導酶活性喪失同時引起其三級結構變化。

        2.5 羊棲菜組分多糖作用于α-葡萄糖苷酶的ANS結合的熒光測定

        圖4 斜率與SEPSⅠ濃度的二級作圖Fig.4 The secondary replot of the slope versus SFPS Ⅰconcentration

        圖5 Y 軸截距與SFPS Ⅰ濃度二級作圖Fig.5 The secondary replot of the Y-intercept versus SFPS Ⅰconcentration

        圖6 不同濃度SFPS Ⅰ作用下α-葡萄糖苷酶的內源熒光變化Fig.6 Changes of intrinsic α-glucosidase fluorescence at different SFPS Ⅰconcentrations

        圖7 最大波長與SFPS Ⅰ濃度二級作圖Fig.7 The secondary replot of the maxium wavelength versus SFPS Ⅰconcentration

        通常情況下,由于疏水性表面變化與總體酶構象變化及其活性位點的構象變化相關,ANS 作為熒光染色劑可以和疏水性的氨基酸結合,用于在檢測酶在抑制劑作用下三級結構的變化情況。 由圖8 可知,隨著體系中SFPS Ⅰ濃度的升高,ANS 結合后外源熒光強度以劑量依賴的方式增加。 當SFPS Ⅰ濃度為0.4 mg·mL-1時,與自然狀態(tài)下相比,α-葡萄糖苷酶疏水性表面基團暴露率增加了30%。 SFPS Ⅰ能誘導α-葡萄糖苷酶活性位點的局部疏水性基團暴露,進一步證實了SFPS Ⅰ與α-葡萄糖苷酶的結合可引起α-葡萄糖苷酶三級結構的明顯變化。

        圖8 不同SFPS Ⅰ濃度下ANS 結合α-葡萄糖苷酶的熒光強度變化Fig.8 Changes in fluorescence intensity of ANS binding α-glucosidase at different SFPS Ⅰconcentrations

        2.6 羊棲菜組分多糖的細胞毒性試驗分析

        由表1 可知,SFPS Ⅰ濃度為10 ~80 μg·mL-1時,與陰性對照組之間無顯著性差異(P>0.05),說明10 ~80 μg·mL-1SFPS Ⅰ對Caco2 細胞無毒性作用。

        2.7 羊棲菜組分多糖對Caco-2 細胞模型的α-葡萄糖苷酶抑制作用

        以體系中SFPS Ⅰ濃度為橫坐標,抑制率為縱坐標(圖9)。 葡萄糖為底物時,SFPS Ⅰ對Caco-2 細胞所表達的α-葡萄糖苷酶有一定的抑制作用,并以計量依賴的方式被抑制。 陽性對照組中Caco-2 細胞所表達的α-葡萄糖苷酶抑制率為35.73%。 當SFPS Ⅰ濃度小于60 μg·mL-1時,隨著SFPS Ⅰ濃度的增加,其對Caco-2 細胞所表達的α-葡萄糖苷酶抑制率隨之增大;當SFPS Ⅰ濃度大于60 μg·mL-1時,其對Caco-2細胞所表達的α-葡萄糖苷酶抑制率趨于平穩(wěn)。

        表1 不同濃度SFPS Ⅰ對Caco-2 細胞的毒性作用Table 1 The cytotoxicity experiment different SFPS Ⅰconcentrations on Caco-2 cells

        圖9 不同濃度SFPS Ⅰ對Caco-2細胞模型的α-葡萄糖苷酶抑制作用Fig.9 The inhibition activity of different SFPS Ⅰconcentration on α-glucosidase of Caco-2 cell model

        3 討論

        α-葡萄糖苷酶的抑制劑多為阿卡波糖或米格列醇的類似物,一些含硫化合物已被證實具有α-葡萄糖苷酶抑制的作用。 目前,已從茶果皮、三七、枸杞等常見植物中分離制備出多糖并應用于抑制α-葡萄糖苷酶的研究[28-30]。 多糖成分結構與抑制α-葡萄糖苷酶活性高低存在明顯的構效關系,在糖/非糖化合物與酶活性部位的結合中,氫鍵也發(fā)揮著十分重要的作用。本研究中,基于抑制動力學試驗,SFPS Ⅰ通過混合型機制抑制酶活性,其作用于α-葡萄糖苷酶時,α-葡萄糖苷酶活性受到抑制且三級結構變化明顯,說明SFPS Ⅰ能夠在α-葡萄糖苷酶活性中心與催化底物pNPG 相關的氨基酸殘基結合,進而影響酶和底物的最大反應速率,這種抑制同時干擾底物進入酶活性中心,導致Km的變化。 SFPS Ⅰ對α-葡萄糖苷酶活性抑制的IC50為0.31 mg·mL-1,優(yōu)于一些天然多糖提取物,如大黃多糖[31];當阿卡波糖濃度為0.32 mg·mL-1時,α-葡萄糖苷酶的抑制率為50%,SFPS Ⅰ的α-葡萄糖苷酶抑制作用與阿卡波糖效果一樣,在一定范圍內可以替代阿卡波糖。

        Caco-2 細胞被廣泛應用于腸內葡萄糖攝取試驗[32],不同類型的膳食成分影響腸道對葡萄糖的攝取,糖苷抑制葡萄糖的主動轉運,糖苷配基抑制葡萄糖的攝取[33]。 桃膠多糖不僅可以抑制腸道內的麥芽糖酶和淀粉酶活性,而且可以競爭性抑制葡萄糖的主動轉運,實現(xiàn)降低餐后血糖的目的[34]。 夏枯草提取物通過抑制Caco-2 細胞中Sglt-1、Glut-2、Na+-K+-ATP 酶mRNA 表達作用,延緩對碳水化合物水解和影響葡萄糖吸收,這可能與降低餐后血糖水平有關[35]。 茶葉中的粗多糖對小腸吸收Caco-2 細胞吸收葡萄糖并無顯著抑制效果[36],不同多糖間引起多糖吸收差異的原因可能與多糖的來源和結構有關。 本研究將SFPS Ⅰ對酶-抑制劑模型和Caco-2 細胞模型上α-葡萄糖苷酶的作用進行了比較,兩者結果不一致,這可能與細胞模型表達的酶量有關。

        4 結論

        羊棲菜活性組分多糖(SFPS Ⅰ)能夠以混合抑制的方式可逆抑制α-葡萄糖苷酶活性,且能夠改變酶的三級結構,對α-葡萄糖苷酶活性抑制能力略高于阿卡波糖。 隨著SFPS Ⅰ濃度的升高,Caco-2 細胞模型中α-葡萄糖苷酶活性下降,進一步佐證了在活體試驗中羊棲菜多糖具有降血糖的功能,今后有必要從抑制葡萄糖轉運子的種類及其基因表達等方面進行深入研究。

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