廖自強，牛海濤，王清水，林堯

福建師范大學 生命科學學院，福建 福州350100

真核生物細胞核包含核孔復合物、核基質(zhì)、核纖層等成分。核纖層是核纖層蛋白（lamins）在內(nèi)核膜的核漿面形成的致密蛋白質(zhì)網(wǎng)狀結構[1]，主要功能是維持細胞核的形態(tài)結構，調(diào)節(jié)核孔復合物之間的間隔[2]，對核組裝、細胞凋亡、細胞信號轉導、DNA 修復等細胞功能具有重要作用[3-6]。蛋白質(zhì)翻譯后修飾是調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)結構功能的一種重要修飾方式，是受到嚴格調(diào)控的一個過程。真核生物中包含至少20種不同的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，如泛素化、SUMO（small ubiquitin-related modifier）化、磷酸化、法尼基化、甲基化等。核纖層蛋白A 作為一種重要的細胞核骨架蛋白，翻譯后修飾對其功能具有較大影響。因此，本文主要概述核纖層蛋白A的翻譯后修飾相關研究進展。

1 核纖層蛋白A的結構與功能

核纖層蛋白是存在于細胞核內(nèi)的V 型中間絲（intermediate filament，IF），具有高度保守的結構域，包括N端球狀區(qū)域、位于中部的α螺旋桿狀域、C端球型尾部區(qū)域。α螺旋桿狀結構域由L1、L12、L2 結構域分為4 段區(qū)域，即1A、1B、2A和2B。2B 結構域后面有一個核定位信號域（nucle?ar localization signal，NLS），是核纖層蛋白進入細胞核所必需的定位信號[7]。C端與核定位信號之間有一個免疫球蛋白樣模序（Ig-fold）。哺乳動物的核纖層蛋白分為A 型（LMNA）和B 型（LMNB），A 型核纖層蛋白主要包括核纖層蛋白A、AΔ10、C、C2，B 型核纖層蛋白主要包括核纖層蛋白B1、B2，其中A、C、B1和B2 是核纖層蛋白的主要組成部分[8-9]。LMNA基因包含12個外顯子，核纖層蛋白A在第10個外顯子處進行剪切形成核纖層蛋白C。核纖層蛋白A和C的N端566個氨基酸殘基相同，核纖層蛋白C 缺少部分10 號外顯子和11、12 號外顯子編碼的氨基酸序列[10]。核纖層蛋白A 前體的C端尾部是由18個氨基酸殘基組成的包含CAAX 模序的特殊結構。

2 核纖層蛋白A的翻譯后修飾

翻譯后修飾對核纖層蛋白A的功能具有重要作用，能影響核纖層蛋白A的穩(wěn)定性、亞細胞定位、與DNA的結合及與其他蛋白質(zhì)的相互作用等。目前研究表明，核纖層蛋白A有多種翻譯后修飾，如法尼基化、SUMO 化、泛素化、磷酸化等。

2.1 核纖層蛋白A的法尼基化修飾

蛋白質(zhì)的異戊二烯化修飾廣泛存在于真核細胞中，主要分為牻牛兒酰牻牛兒基化修飾和法尼基化修飾[11]。核層蛋白A 前體需要進行法尼基化修飾才能形成成熟的核纖層蛋白A。核纖層蛋白A 前體的C端（-CSIM）是CAAX 模序，可以引發(fā)法尼基化修飾。首先，法尼基蛋白轉移酶（FTase）識別核纖層蛋白A 前體尾端的-CSIM 序列，將聚異戊二烯基團連接到半胱氨酸的硫醇基上；然后，C端的3個氨基酸殘基SIM 被金屬蛋白酶ZMPSTE24（zinc metalloproteinase Ste24）和RCE1（Ras and α-factor converting enzyme）單個或者2個酶共同作用剪除，這2個酶在剪切過程中哪個起主要作用尚未確定[12]；下一步，結合在半胱氨酸上的聚異戊二烯基團在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中被異戊烯半胱氨酸羧基端甲基轉移酶（isoprenylcysteine carbox?yl methyltransferase，ICMT）進行甲基化修飾[13]；最后，核纖層蛋白A 前體在金屬蛋白酶ZMPSTE24的作用下切除包括法尼基化和羧甲基化半胱氨酸在內(nèi)的15個C端氨基酸殘基（647～661 aa），最終形成成熟的核纖層蛋白A（1～646 aa）[14]。

核纖層蛋白A 前體C端的-CSIM 發(fā)生法尼基化修飾后使C端疏水性更強，可以更好地定位和保留在核內(nèi)膜；然而核纖層蛋白C 不包含CAAX結構，但是也可以定位在核膜。因此，法尼基化修飾化可能并不是核纖層蛋白A 定位到核膜不可或缺的過程[15]。核纖層蛋白A 一旦定位到核膜，就被酶進一步加工除去C端包括法尼基團在內(nèi)的18個氨基酸殘基，然而B 型核纖層蛋白一直保持法尼基化的狀態(tài)。法尼基化修飾過程較快，一般無法檢測到該過程。

2.2 核纖層蛋白A的SUMO 化修飾

SUMO 是廣泛存在于真核生物中的類泛素多肽，目前在哺乳動物中已發(fā)現(xiàn)4種SUMO基因，即SUMO-1、SUMO-2、SUMO-3、SUMO-4[16-17]。SUMO化作為一種類泛素化修飾，其反應過程是一種與泛素反應過程相似的級聯(lián)反應，修飾過程一般由3種酶催化，即E1 激活酶、惟一的E2 結合酶UBC9（ubiquitin-conjugating 9）和E3 連接酶。SUMO 化修飾可以調(diào)節(jié)蛋白的穩(wěn)定性、蛋白的亞細胞定位，干擾蛋白間的結合，改變蛋白的構象而暴露或隱藏與其他蛋白結合的位點等[18-19]。SUMO 化是一個動態(tài)可逆的過程，SUMO的特異性蛋白酶（sentrin/SUMO-specific protease，SENP）可將SUMO與修飾的蛋白從結合狀態(tài)解離，稱為去SUMO 化。

Zhong 等[20]用酵母雙雜交系統(tǒng)檢測到核纖層蛋白A與UBC9 存在相互作用關系，暗示核纖層蛋白A 可能存在SUMO 化修飾。Zhang 等[21]在HeLa細胞中，用核纖層蛋白A 抗體免疫共沉淀內(nèi)源SUMO1、SUMO2/3，檢測到SUMO2/3 可以與核纖層蛋白A 發(fā)生共沉淀，所以核纖層蛋白A 可能與SUMO2/3 結合發(fā)生SUMO 化修飾，通過對核纖層蛋白A 序列的分析，在高度保守的桿狀區(qū)域K201位置預測到SUMO的識別與結合模序MKXE（rep?resents hydrophobic amino acids），對K201 進行突變（K201R），檢測結果顯示SUMO2/3與突變后的核纖層蛋白A 共沉淀明顯變少，進一步對結合模序MKXE的E 進行突變（E203G，E203K），發(fā)現(xiàn)E位點突變后與K201 突變具有相似效果，共沉淀也明顯減少，所以MKXE 模序?qū)UMO 化修飾具有重要作用。此外，K201R、E203G、E203K 位點單獨突變后進行熒光定位檢測，發(fā)現(xiàn)大量核纖層蛋白A 聚集成點位于細胞核內(nèi)或核周，并且檢測到突變后促進細胞的凋亡，說明SUMO 修飾位點突變后影響核纖層蛋白A的定位和凋亡。

Simon 等[22]在Cos-7細胞中發(fā)現(xiàn)核纖層蛋白A能與SUMO1和SUMO2 結合，體外實驗檢測結果表明SUMO1 對核纖層蛋白A 尾部區(qū)域的親和性比SUMO2 更強。通過多個SUMO 化修飾預測軟件比對選出潛在的核纖層蛋白A 尾部區(qū)域SUMO修飾的位點，分別對篩選到的位點進行點突變后做共沉淀實驗，結果顯示只有K420 位點突變成R后與SUMO1的結合明顯變少，同時對非SUMO 識別序列位點K486 進行點突變后通過共沉淀實驗也發(fā)現(xiàn)SUMO1 結合減少。因此有觀點提出，K486能與SUMO 結合的原因可能是因為該位點處由多個酸性殘基形成一個UBC9 識別的位點。

Sharma 等[23]在MEFs細胞中用免疫共沉淀方法檢測到去SUMO 化酶SENP1 可以與核纖層蛋白A 結合，在SENP1表達缺失的MEFs細胞中核纖層蛋白A表達量上升。而且已有報道核纖層蛋白A蛋白可以被SUMO 化修飾，因此SENP1表達的缺失可能是由于去SUMO 化作用的減少導致核纖層蛋白A表達上升。

2.3 核纖層蛋白A的泛素化修飾

泛素是廣泛存在于真核細胞中的由76個氨基酸殘基組成的高度保守蛋白。將泛素傳遞到靶標蛋白進行結合需要泛素激活酶（E1）、泛素結合酶（E2）和泛素連接酶（E3）的參與，這3種酶進行級聯(lián)反應將泛素進行傳遞，最終泛素才能與靶標蛋白進行結合和標記[24]。泛素標記的靶標蛋白可通過26S 蛋白酶體進行降解[25]，介導真核生物體內(nèi)80%～85%的蛋白質(zhì)降解；或者不經(jīng)過26S 蛋白酶體作用，改變靶蛋白的構象和功能，調(diào)節(jié)其定位和分布[26]。蛋白質(zhì)的泛素化是動態(tài)、可逆的結合修飾過程。靶蛋白上的泛素可被去泛素化酶（deubiquitin，DUB）作用脫離，稱為去泛素化。

Sharma 等[23]在MEFs細胞中加入蛋白酶體抑制劑MG132，檢測內(nèi)源核纖層蛋白A 蛋白的表達。當加MG132后，與未加的MEFs細胞相比核纖層蛋白A的表達明顯上升。并且在SENP1突變、SUMO1突變、SUMO1和SENP1同時突變的MEFs細胞中加入MG132后，核纖層蛋白A的表達均有上升。因此，核纖層蛋白A 可能受到泛素的修飾進而發(fā)生泛素-蛋白酶體途徑的降解。采用高通量質(zhì)譜分析方法，Wagner 等[27]利用HEK293T細胞、Kim 等[28]利用結腸腺癌細胞CT116，均檢測出核纖層蛋白A 潛在的多個泛素化位點。

2.4 核纖層蛋白A的磷酸化修飾

蛋白質(zhì)發(fā)生磷酸化主要是由蛋白質(zhì)激酶催化作用將ATP 或GTP的γ位磷酸基轉移至特定底物蛋白氨基酸殘基的過程[29]，是一種在生物體內(nèi)廣泛存在且非常重要的翻譯后修飾方式，細胞內(nèi)超過30%的蛋白質(zhì)可發(fā)生磷酸化修飾。

核纖層蛋白A 含有多個保守的激酶識別位點，可被多種激酶磷酸化。目前發(fā)現(xiàn)的核纖層蛋白A的磷酸化位點已經(jīng)超過30個，有些磷酸化位點在細胞有絲分裂期間發(fā)生磷酸化，伴隨著核纖層蛋白多聚體的解聚，最終導致核膜的裂解。在細胞分裂間期，磷酸化會被磷酸化酶進行去磷酸化反應，這使得解聚的核纖層蛋白重新聚合形成致密內(nèi)核膜結構[30]。核纖層蛋白分解和聚集依賴磷酸化和去磷酸化，這是細胞周期過程細胞核的保守功能。

周期蛋白依賴性激酶CDK1 可以分別磷酸化核纖層蛋白A 位于N端區(qū)域的S22和尾部區(qū)域的S392，有研究表明這2個位點其中一個發(fā)生磷酸化就足以使核纖層蛋白A 發(fā)生解聚[31-32]。HeLa細胞中用磷酸化特異性抗體檢測結果表明，有絲分裂過程中核纖層蛋白T19、S22、S393和S636 位點的磷酸化增加2～6倍[33]。也有報道其他激酶也可以磷酸化核纖層蛋白A 位點導致解聚[34-35]。核纖層蛋白A的S404 同時是PKC和AKT 這2個蛋白激酶的磷酸化位點，PKC 激酶磷酸化核纖層蛋白A 可以促進其進入細胞核[36]。將核纖層蛋白A的S403和S404 位點進行突變，即突變后位點不能發(fā)生磷酸化（S403A和S404A），突變后發(fā)現(xiàn)可以抑制其進入細胞核，所以磷酸化可以影響核纖層蛋白A在細胞內(nèi)的定位[34,37]。在生理條件下AKT 可以使核纖層蛋白A的S301和S404 位點發(fā)生磷酸化，而且核纖層蛋白A 前體S404 位點發(fā)生磷酸化后可促進其前體蛋白的降解。將外源核纖層蛋白A 前體的S403和S404 位點進行突變，即突變模擬發(fā)生磷酸化（S403D和S404D），突變后發(fā)現(xiàn)核纖層蛋白A 前體主要分散在細胞質(zhì)中，所以磷酸化影響核纖層蛋白A 前體的細胞定位[38]。PKC 家族成員磷酸化核纖層蛋白A 除了可以使核膜裂解外還具有其他功能，如核纖層蛋白A的Ig-fold區(qū)域的S525只在細胞分裂間期才發(fā)生磷酸化，所以并不參與細胞核的分裂調(diào)控[37]。核纖層蛋白A的S404 可以被S6-kcinaseⅡ磷酸化[39]，并且在各種細胞中該位點都有被修飾的情況，但是功能還不清楚。

3 核纖層蛋白A 翻譯后修飾之間的相互作用

蛋白質(zhì)的翻譯后修飾在生命活動過程中發(fā)揮著關鍵的調(diào)節(jié)作用，該過程的異常將直接影響蛋白質(zhì)功能的正常執(zhí)行，從而引發(fā)相關疾病甚至癌癥。核纖層蛋白A的翻譯后修飾可能作用于同一氨基酸殘基，也可能因為修飾后改變蛋白的構象或定位而影響其他的翻譯后修飾過程。

Sharma 等[23]在MEFs細胞中將已報道的核纖層蛋白A的3個SUMO 化修飾位點進行點突變（核纖層蛋白A-3KR），與未進行突變的核纖層蛋白A 分別轉染野生型MEFs細胞和SENP1 突變的MEFs細胞，檢測核纖層蛋白A的表達。與轉染未突變的核纖層蛋白A 相比較，在MEFs細胞中轉染核纖層蛋白A-3KR后，核纖層蛋白A-3KR表達下降；與轉染未突變的核纖層蛋白A 相比較，在SENP1 突變的MEFs細胞中轉染核纖層蛋白A-3KR后，核纖層蛋白A-3KR的表達也是下降的。因此，SUMO 化修飾對核纖層蛋白A在野生型和SENP1 突變型MEFs細胞中都具有穩(wěn)定核纖層蛋白A表達的功能。在野生型MEFs細胞和SENP1突變的MEFs細胞中分別轉染核纖層蛋白A 或核纖層蛋白A-3KR，SENP1 突變的MEFs細胞中核纖層蛋白A的表達都較高。因此，SENP1的缺失可以提高核纖層蛋白A的表達，同時核纖層蛋白A 可能還含有別的SUMO 化修飾位點。在野生型MEFs細胞和SENP1 突變的MEFs細胞中加入蛋白酶體抑制劑MG132，可以提高內(nèi)源核纖層蛋白A蛋白的表達。核纖層蛋白A 可能會受到泛素的修飾進而發(fā)生泛素-蛋白酶體途徑的降解，所以核纖層蛋白A 進行SUMO 化修飾可能具有保護其不被泛素蛋白酶降解的功能。核纖層蛋白A 作為V 型中間絲，與其他中間絲蛋白結構具有一定的保守性（桿狀結構域高度保守），特別是其N端的16個氨基酸殘基和C端的30個氨基酸殘基的保守性最高[40]。已經(jīng)有報道，高磷酸化的中間絲蛋白經(jīng)常伴隨泛素化的發(fā)生，有觀點提出磷酸化的存在可能具有招募泛素連接酶的能力，因此磷酸化和泛素化之間存在的機制須進一步探討[41]。此外，也有報道中間絲蛋白的泛素化與蛋白酶體抑制劑具有一定關系[42]。

4 結語

核纖層蛋白A 作為核骨架蛋白維持細胞核結構功能形態(tài)的穩(wěn)定，有研究發(fā)現(xiàn)其表達變化不僅能影響細胞核的可變形性，也能影響癌細胞的遷移功能。核纖層蛋白A 翻譯后修飾的過程受到一系列酶的嚴格調(diào)控，翻譯后修飾影響其表達、定位以及與其他蛋白的相互作用等。然而核纖層蛋白A的翻譯后修飾在細胞中的功能，以及核纖層蛋白A 各種翻譯后修飾之間的相互作用關系都亟需深入挖掘。進一步開展核纖層蛋白A的翻譯后修飾研究，對于深入探究細胞核結構功能的穩(wěn)態(tài)具有重要意義。