柯丹霞 徐勤朕 楊娜 柏夢焱 關(guān)躍峰

（1. 福建農(nóng)林大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，福州 350002；2. 福建農(nóng)林大學(xué)海峽聯(lián)合研究院 園藝植物生物學(xué)及代謝組學(xué)研究中心，福州 350002）

氮素是限制植物產(chǎn)量最主要的元素。雖然豆科植物既可以利用根瘤固定的氮，也可以利用根系吸收的氮，但是當(dāng)土壤中氮素含量較高時，根瘤的數(shù)量、發(fā)育和固氮活性會受到抑制，造成共生固氮效率的下降，即“氮阻遏”效應(yīng)［1-2］。目前，關(guān)于高氮對豆科植物結(jié)瘤固氮的抑制作用已有大量文獻報道，但其中的分子機制仍有待進一步明確。闡明高氮抑制豆科植物結(jié)瘤固氮的機制對挖掘豆科植物的固氮能力，減少氮肥的投入以及增加豆科植物的產(chǎn)量等具有重要意義。

1 豆科植物與根瘤菌的共生固氮

根瘤的形成包括宿主植物與根瘤菌間信號識別、侵染線形成、根瘤原基形成以及根瘤成熟等一系列復(fù)雜的過程。宿主植物首先分泌類黃酮化合物，根瘤菌釋放結(jié)瘤因子（Nod factor，NF），植物根系接收NF信號后，產(chǎn)生一系列早期結(jié)瘤信號反應(yīng)，包括Ca2+流入、Ca2+振蕩等。與此同時，根的皮層細胞開始分裂，根瘤菌通過侵染線進入根皮層形成根瘤原基，進而形成根瘤［3］。

固氮作用主要發(fā)生在成熟根瘤的類菌體內(nèi)，由固氮酶將氮氣轉(zhuǎn)化為NH4+。根瘤菌的固氮作用是一個耗能的過程，所需碳源由蔗糖提供，蔗糖在葉片中合成并通過韌皮部運輸?shù)礁鲋?，根瘤中的蔗糖分解代謝為己糖后，進一步通過糖酵解代謝產(chǎn)生磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）。隨后，PEP可羧基化為草酰乙酸，草酰乙酸可被蘋果酸脫氫酶還原為蘋果酸。根瘤菌利用碳源固氮的反應(yīng)式為：N2+ 8H++ 8e-+16ATP ? 2NH3+ H2+ 16ADP + 16Pi［4-5］。

2 高氮抑制結(jié)瘤的機制研究進展

豆科植物與根瘤菌形成共生體——根瘤，這種互利模式有利于豆科植物在氮素營養(yǎng)不足的土壤中生存。但是，根瘤的固氮作用需要消耗植物自身的碳源，為了維持碳氮平衡，豆科植物在長期進化過程中發(fā)展出了一套負反饋調(diào)節(jié)機制，使已經(jīng)形成的根瘤能夠抑制新的根瘤的形成，被稱為結(jié)瘤自主調(diào)控 機 制（Autoregulation of nodulation，AON）［6-8］。AON被認為由根起源和莖起源的兩類長距離信號分子組成，該途徑涉及根-莖之間的長距離信號交流，并與早期NF信號緊密相連。豆科植物的根響應(yīng)NF信號并產(chǎn)生信號分子轉(zhuǎn)移到莖中；同時，莖中也產(chǎn)生信號分子并轉(zhuǎn)移到根中，限制進一步結(jié)瘤［9］。百脈根的har1、大豆的nark、苜蓿的sunn等突變體都呈現(xiàn)超結(jié)瘤表型，但根的生長受到抑制［10］。這是一種莖特異性的信號調(diào)節(jié)模式。這類基因都編碼一類富含亮氨酸重復(fù)序列的受體蛋白激酶（LRR receptorlike kinase）。

過去的研究表明，AON途徑參與了高氮對結(jié)瘤數(shù)量的抑制。nark/har/sunn突變體在高硝酸鹽下仍表現(xiàn)出超結(jié)瘤表型［10-11］。AON中的CLE信號肽基因不僅對根瘤菌侵染有響應(yīng)，而且對硝酸鹽也有響應(yīng)［8，12-13］。在百脈根（Lotus japonicus）中，klv［14］和 tml［9］突變體也表現(xiàn)出高濃度硝酸鹽下根瘤數(shù)量的顯著增加?；谝陨涎芯拷Y(jié)果，推測硝酸鹽調(diào)控結(jié)瘤的分子機制涉及一個類似于AON的系統(tǒng)［9，15-16］。然而，AON途徑突變體在高氮條件下，雖然結(jié)瘤數(shù)量增加，但根瘤發(fā)育及固氮活性仍受到顯著抑制［16-17］。說明僅AON途徑不足以完全解釋高氮抑制結(jié)瘤的機制，可能還存在其他機制的參與。

結(jié)瘤調(diào)控因子NIN（Nodule inception）的同源蛋白NLP（NIN-Like Protein）包括3個保守結(jié)構(gòu)域：負責(zé)硝酸鹽響應(yīng)的N末端結(jié)構(gòu)域、RWP-RK的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和參與蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的PB1結(jié)構(gòu)域［18］。在蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）中發(fā)現(xiàn)一個nlp1突變體，其根瘤數(shù)量和發(fā)育對硝酸鹽不敏感。NLP1通過核-質(zhì)穿梭響應(yīng)并傳遞硝酸鹽信號，NLP1響應(yīng)硝酸鹽進入細胞核，通過PB1結(jié)構(gòu)域與NIN形成復(fù)合體，抑制NIN對下游CRE1和NF-YA1等基因的激活，最終抑制根瘤的形成及氮素的固定。當(dāng)環(huán)境中存在充足硝酸鹽時，NIN的表達受到抑制，同時NLP1（和其他NLPs）進入細胞核，與NIN形成復(fù)合體，和NIN競爭結(jié)合位點，抑制NIN對下游基因的激活，最終無法形成根瘤［19］。在百脈根（L.japonicus）中，也發(fā)現(xiàn)了與苜蓿（M. truncatula）類似的機制。NRSYM1基因編碼NLP轉(zhuǎn)錄因子，以硝酸鹽依賴性方式直接與CLE-RS2啟動子上的NBS/NRE結(jié)合［20-21］。NRSYM1與NIN可能存在拮抗機制，用于調(diào)控其共同靶基因的表達。在高氮條件下NRSYM1定位于細胞核［20］，推測NRSYM1可能被硝酸鹽依賴的核定位機制激活并直接調(diào)節(jié)CLE-RS2的產(chǎn)生，從而通過AON途徑負調(diào)控結(jié)瘤數(shù)目［22-24］。以上研究揭示了NLP基因家族在硝酸鹽抑制共生結(jié)瘤過程中的重要作用，為提高豆科植物應(yīng)對“氮阻遏”奠定了理論基礎(chǔ)。

植物激素對于結(jié)瘤也具有重要的調(diào)節(jié)作用。乙烯是結(jié)瘤的負調(diào)控因子。蒺藜苜蓿（M. truncatula）中乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白突變體表現(xiàn)出超結(jié)瘤表型［25］。在苜蓿中高氮可增強根中乙烯的產(chǎn)生；此外，高氮對根瘤形成的抑制作用可以通過乙烯生物合成的抑制劑氨基乙氧基乙烯基甘氨酸AVG部分地抑制［25］。此外，在百脈根中，參與細胞分裂素降解的細胞分裂素氧化酶脫氫酶3的突變會增強硝酸鹽對結(jié)瘤和固氮的抑制作用，這表明高氮抑制結(jié)瘤固氮過程可能與細胞分裂素活性有關(guān)［26］。

3 高氮抑制根瘤固氮活性的假說爭議及研究進展

成熟根瘤的固氮活性受到環(huán)境中氮素的可逆抑制［27］，與氮素抑制根瘤數(shù)量及發(fā)育的研究相比，固氮活性受氮素調(diào)節(jié)的機制仍知之甚少。關(guān)于高氮抑制根瘤固氮的原因，人們提出了許多假說，其中亞硝酸鹽毒性和碳饑餓兩種假說較為人知，但仍存在爭議。

3.1 高氮對根瘤固氮的亞硝酸鹽毒性假說

根瘤中的硝酸鹽代謝在高氮抑制固氮酶活過程中發(fā)揮重要作用。硝酸還原酶將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，亞硝酸鹽可能對細胞產(chǎn)生毒性。此外，亞硝酸鹽進一步代謝產(chǎn)生一氧化氮（NO）［28］。豆血紅蛋白（Leghemoglobin，Lb）對NO的親和力高于對氧氣O2的親和力［29］。因此，Lb-NO的形成可能抑制O2向根瘤菌的供應(yīng)［30］。在用硝酸鹽處理的大豆根瘤中發(fā)現(xiàn)了Lb-NO的形成［31］。外源添加硝酸鹽增加了百脈根根瘤中NO的產(chǎn)生，并且NO參與高氮對根瘤固氮活性的抑制［32］。豌豆（Pisum sativum）硝酸還原酶缺陷型突變體減弱了高氮對根瘤固氮活性的抑制作用［33］。因此，亞硝酸鹽毒性假說認為，氮素經(jīng)過氮同化及代謝產(chǎn)生亞硝酸鹽是導(dǎo)致根瘤固氮活性受抑制的主要原因［34］。

然而，利用硝酸還原酶缺乏的根瘤菌突變體開展研究卻得到了與上述假說相矛盾的結(jié)果。在接種上述突變體根瘤菌的根瘤中檢測不到亞硝酸鹽，或只能檢測到很低水平的亞硝酸鹽，不足以對固氮活性產(chǎn)生抑制作用［35］。然而根瘤的固氮酶活仍顯著降低，說明根瘤中亞硝酸鹽的積累與固氮酶活性的下降之間可能并沒有直接的因果關(guān)系。Sprent等［36］也提供了與亞硝酸鹽毒性假說相矛盾的證據(jù)。大豆根瘤皮層或木質(zhì)部中的硝酸鹽在短期（≤3 d）內(nèi)不能被輸送到根瘤侵染區(qū)。因此，侵染區(qū)由于缺乏硝酸還原酶的底物，不能產(chǎn)生亞硝酸鹽。所以亞硝酸鹽毒性假說仍存在爭議。

3.2 高氮對根瘤固氮的碳饑餓假說

碳饑餓假說認為，高氮導(dǎo)致根瘤中碳分配減少，碳供應(yīng)不足導(dǎo)致根瘤固氮活性下降［27，37-38］。研究發(fā)現(xiàn)高氮對水培大豆根瘤生長和固氮酶活的抑制作用，與根瘤中光合同化物的減少相一致。銨態(tài)氮、尿素、谷氨酰胺和硝酸鹽處理的大豆，13C在根瘤中的分布相對較低，根瘤中光合碳供應(yīng)的減少可能抑制了根瘤生長和固氮酶活。因此大豆可能通過改變根瘤和根之間光合同化物的分配來調(diào)控根瘤生長和固氮酶活。最近的轉(zhuǎn)錄組和代謝組分析顯示，硝酸鹽處理促進大豆根系中的碳氮代謝，而根瘤中的碳氮代謝被抑制。推測硝酸鹽促進了根系的碳利用，從而減少了碳向根瘤的運輸。碳供應(yīng)的減少除了可能影響能量和碳骨架代謝外，也可能減少氧氣向根瘤的擴散［39］。將豆科植物暴露在硝酸鹽中，根瘤中碳水化合物的分配減少，而其他植物器官中碳水化合物的分配增加。根瘤中碳的減少導(dǎo)致根瘤缺乏固氮所必需的還原劑、ATP和碳骨架，這可能是根瘤碳饑餓抑制固氮酶活的主要原因。

高氮對根瘤固氮的碳饑餓假說主要依賴以上研究的生理實驗證據(jù)。然而，以上證據(jù)難以證明，碳分配減少與固氮活性降低之間的因果關(guān)系。首先，很難（或不可能）確定豆科植物暴露于硝酸鹽后碳水化合物在根瘤中的減少是固氮酶活下降的原因。研究人員試圖通過觀察硝酸鹽抑制固氮酶活時，代謝物的變化來解釋這一問題。淀粉濃度下降是根瘤碳饑餓的一個指標(biāo)［40］。Vessey等［41］證明大豆固氮酶活下降的同時，根瘤中淀粉（而非可溶性糖）濃度也開始下降（暴露在硝酸鹽中24 h內(nèi)）。在菜豆（Phaseolus vulgaris）和豌豆（Pisum sativum）中類似的試驗獲得了相反的結(jié)論。根瘤固氮酶活的下降并不影響淀粉濃度的變化。豌豆與大豆植株暴露于硝酸鹽后，根瘤中的蘋果酸和琥珀酸等有機酸濃度增加。這些結(jié)果表明，暴露在硝酸鹽中并不會使根瘤中的碳骨架失去固定氮的輔助作用，也不會使有機酸失去活性。因此，如果根瘤中的碳饑餓是硝酸鹽抑制固氮酶活的一個原因，那么它必須通過另一種機制，而不是碳饑餓假說中提出的機制。

4 合理施氮，節(jié)本增產(chǎn)

豆科植物有3種氮來源，即土壤氮素、施加氮肥和根瘤固定大氣中的氮，三者之間既相輔相成，又相互制約，共同為豆科植物提供生長發(fā)育所需要的氮素營養(yǎng)。以豆科作物大豆為例，在大豆生育早期，氮素主要來自土壤，接著肥料氮也開始起重要作用，從生育中期以后，共生固定的氮在總攝取量中所占的比例越來越大；相反，土壤氮和肥料氮所占比例呈下降趨勢。研究表明，大豆植株所吸收的土壤氮和肥料氮較多地進入了營養(yǎng)器官，而根瘤共生固定的氮較多的分配在結(jié)實器官中［42］，也就是說，根瘤所固定的氮更多的集中在大豆籽粒之中，大豆在營養(yǎng)生長與生殖生長并進時期，提高根瘤固氮的能力，有利于對大豆籽粒的形成，最后達到高產(chǎn)。

雖然共生固氮是固氮效率最高的一種生物固氮形式，但共生固氮僅能滿足豆科植物50%左右的氮素需求，特別是在豆科植物生長過程中的苗期和成熟期，在苗期，共生固氮系統(tǒng)尚未完全建立，而成熟期共生固氮系統(tǒng)又開始逐漸衰亡，因此這兩個時期尚需補充額外氮源［43］。在大豆生長生育前期，根系結(jié)瘤較少，生物固氮能力較弱，而土壤氮素及肥料氮素則成為大豆植株各營養(yǎng)器官最主要的氮素來源，因此大豆苗期可適量施氮肥，控制前期生長過于旺盛。隨著生育時期的推進，大豆根系結(jié)瘤逐漸增多，根瘤固氮能力也逐漸提高，此時，無需額外施加氮肥。在大豆生長發(fā)育后期，尤其是生殖器官形成階段追施氮肥，可促進后期干物質(zhì)的快速積累及向莢果中的轉(zhuǎn)化，明顯增加大豆產(chǎn)量［44］。相反，施加過高濃度的氮肥或在大豆生長發(fā)育不必要的階段施入氮肥，不僅降低根瘤聯(lián)合固氮效果，而且也會降低大豆產(chǎn)量［45］。若在大豆整體生長過程中出現(xiàn)氮素供應(yīng)不足，未能滿足大豆氮素需求，就會產(chǎn)生氮素由葉片向籽粒轉(zhuǎn)移的狀況，從而降低光合作用能力，降低大豆產(chǎn)量［46］。因此，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中合理調(diào)整施氮時期及施氮量，才能達到節(jié)本增產(chǎn)的效果。

5 展望

高氮抑制豆科植物結(jié)瘤的多樣性導(dǎo)致高氮抑制結(jié)瘤機制的復(fù)雜性，不論是豆科植物AON途徑還是植物激素途徑都不足以完全闡明高氮抑制結(jié)瘤的機制。高氮抑制固氮活性的具體機制尚不明確，人們提出的亞硝酸鹽毒性和碳饑餓兩種假說仍存在爭議。氮肥的過量施用會抑制豆科植物的結(jié)瘤固氮，使豆科植物不能發(fā)揮出全部的固氮能力。因此，更詳細系統(tǒng)地理解高氮抑制豆科植物結(jié)瘤固氮的分子機制，可以更好地調(diào)控共生固氮，從而有效利用空氣中的氮素，減少或避免氮肥的抑制，增加豆科植物的氮同化和氮攝取，增加豆科作物產(chǎn)量的同時，改善土壤結(jié)構(gòu)與環(huán)境，這對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)有著極其重要的理論和指導(dǎo)意義。