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(1.西京學院醫(yī)學院,陜西西安 710000; 2.昆明理工大學生命科學與技術學院,云南昆明 650500)

乳酸菌胞外多糖(exopolysaccharides,EPS)是乳酸菌在生長代謝過程中分泌到細胞外的一種糖類化合物[1],是乳酸菌在長進化過程中適應環(huán)境的產物,不僅可以保護菌體而且因其具有調節(jié)皮膚免疫力、抗腫瘤、抗炎以及免疫調節(jié)等作用,在諸如化妝品、制藥、食品等生物技術方面得以應用[2-6]。

本研究從四川傳統發(fā)酵泡菜中分離得到的三株高產胞外多糖的副干酪乳桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)液中提取其生物合成的胞外多糖,對其體內外抗氧化特性進行研究,以期為擴大乳酸菌的綜合利用,以及乳酸菌胞外多糖在食品體系中作為一種具有抗氧化性質的新型添加劑提供理論基礎依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

副干酪乳桿菌3號、5號和7號三株菌株 均來源于昆明理工大學生命科學與技術學院應用微生物組從四川傳統發(fā)酵泡菜中分離獲得,并在-80 ℃下含20%甘油的MRS培養(yǎng)基中儲存;蛋白胨、牛肉膏、酵母粉 OXOID LTD.;葡萄糖、無水乙醇 西隴化工股份有限公司;三水合磷酸氫二鉀 廣東光華科技股份有限公司;乙酸鈉、七水硫酸鎂、四水硫酸錳、檸檬酸鉀、碳酸氫鈉、苯酚、抗壞血酸、過氧化氫、硫酸亞鐵 天津市風船化學試劑科技有限公司;Tween-80、DPPH自由基、亮綠、鄰苯三酚 Solarbio公司;三氯乙酸 天津市光復精細化工研究所;乙二胺四乙酸 生工生物工程(上海)有限公司;硫酸 重慶川東化工(集團)有限公司;杜爾伯科極限必需培養(yǎng)基(DMEM) 德國Invitrogen公司;MDA、SOD、T-AOC測定試劑盒 上海世鋒生物科技有限公司。

SI-234天平 德國Denver Instrument公司;Autoclave SX-500滅菌鍋 TOMY公司;GRX-9123A烘箱 上海齊欣科學儀器有限公司;SW-CJ-1FD超凈工作臺 蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司;GL-3250A磁力攪拌器 AS ONE公司;GHP-9160培養(yǎng)箱 上海一恒科學儀器有限公司;YC-300L冰箱 中科美菱低溫科技有限責任公司;3-18K124178離心機 SIGMA公司;透析袋(1000) 美國聯合碳化公司;FD5-12真空冷凍干燥機 SIM公司;Biochrom Ultrospec 2100 pro UV分光光度計 美國柏楉有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制 MRS培養(yǎng)基:蛋白胨10 g/L,牛肉膏8 g/L,酵母粉4 g/L,葡萄糖20 g/L,三水合磷酸二氫鉀2 g/L,乙酸鈉5 g/L,七水硫酸鎂0.2 g/L,四水硫酸錳0.05 g/L,檸檬酸三銨2 g/L,Tween 80 1 mL/L。

MRS改良培養(yǎng)基[17]:葡萄糖20 g/L,酵母粉30 g/L,三水合磷酸二氫鉀2 g/L,乙酸鈉5 g/L,七水硫酸鎂0.2 g/L,四水硫酸錳0.05 g/L,檸檬酸三銨2 g/L,Tween 80 1 mL/L。

1.2.2 菌株的活化與培養(yǎng) 將三株副干酪乳桿菌從-80 ℃取出后按體積分數2%的接種量接種至含有5 mL MRS基本培養(yǎng)基的試管中培養(yǎng)12 h。傳代培養(yǎng)2次后再按體積分數2%的接種量轉接至新鮮的含有500 mL MRS改良培養(yǎng)基的錐形瓶中37 ℃培養(yǎng)24 h。

1.2.3 胞外多糖分離純化 將細菌培養(yǎng)液于4 ℃、10000×g離心15 min,除去細胞,在上清中加三氯乙酸(TCA)至質量分數為4%,并在室溫下震蕩搖勻,靜置30 min,10000×g離心15 min去除沉淀蛋白;離心后的上清中加三倍體積的預冷無水乙醇沉淀,-20 ℃過夜;4 ℃、12000×g離心30 min收集沉淀;將沉淀用ddH2O溶解,轉移到經過前處理(將透析袋根據自己的需要剪成適當的長度,一般為10～20 cm的小段;在大體積的質量體積比為2%碳酸氫鈉和1 mmol/L的乙二胺四乙酸(EDTA,pH8)的溶液中,將透析袋煮沸10 min;用蒸餾水徹底清洗透析袋;再用1 mmol/L的EDTA(pH8)溶液將透析袋煮沸10 min;冷卻后存放于4 ℃冰箱中)的透析袋中透析2 d,期間每8 h換水一次;收集透析液后真空冷凍干燥[18]。

1.2.4 總糖量測定 將冷凍干燥后的三株副干酪乳桿菌胞外多糖用ddH2O溶解,利用苯酚-硫酸法[19]測定胞外多糖產量。以葡萄糖為標準品制作標準曲線,得到回歸方程:y=14.929x+0.007,R2=0.9996,曲線擬合良好,并通過回歸方程計算副干酪乳桿菌的胞外多糖產量。

1.2.5 胞外多糖體外抗氧化活性測定 稱取冷凍干燥的胞外多糖樣品,配制為400 μg/mL的母液,再用ddH2O稀釋為濃度梯度100、200、300、400 μg/mL備用。同時以相同濃度的抗壞血酸作為陽性對照。

1.2.5.1 DPPH·的清除率 副干酪乳桿菌胞外多糖清除DPPH·(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)的測定參考Hromádková等[20]的方法并稍加修改,在試管中加入1.0 mL樣品溶液,室溫下避光靜置30 min,測定517 nm處的吸光值A樣;同時,測定1.0 mL樣品溶液與2.0 mL無水乙醇混合液在517 nm 處的吸光度A對,再測定2.0 mL DPPH·溶液與1.0 mL 70%乙醇溶液在517 nm 處的吸光值A空,每個濃度三組重復。按式(1)計算DPPH·清除率:

式(1)

1.2.5.2 ·OH的清除率 本試驗參考Pan等[8]的方法對胞外多糖清除·OH的能力進行分析,并略有改進:將1.0 mL亮綠(C27H34N2O4S,0.435 mmol/L),2.0 mL FeSO4(0.5 mmol/L),1.5 mL H2O2(3.0% W/V分別加入到1 mL不同濃度干酪乳桿菌胞外多糖常溶液常溫下分別混合搖勻,常溫靜置20 min測定波長624 nm下吸光值。按式(2)計算·OH清除率:

式(2)

式中:AS為樣品的吸光度;A0為不加樣品的吸光度;A為不加樣品和Fenton反應體系的吸光度。

式(3)

式中:Aa為不加樣品,但加入鄰苯三酚的吸光度;Ab為加入樣品和鄰苯酚的吸光度;Ac為加入樣品,但不加鄰苯三酚的吸光度。

1.2.6 胞外多糖緩解293T細胞氧化損傷能力評價實驗 由于副干酪乳桿菌胞外多糖在體外抗氧化活性分析中沒有顯著性差異,因此在研究緩解293T細胞氧化損傷能力評價實驗中僅選取3號菌株作為研究對象。

1.2.6.1 293T細胞系的培養(yǎng)及處理 人體腸上皮細胞系293T細胞在杜爾伯科極限必需培養(yǎng)基及5%的CO2氣體37 ℃條件下常規(guī)培養(yǎng),添加10%(v/v)滅活的胎牛血清和混合抗生素,混合抗生素最終濃度分別為100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素和25 U/mL兩性霉素B。將1 mL細胞懸液(密度為2×105個/mL)接種于6孔板孵育細胞附著培養(yǎng)。孵育培養(yǎng)12 h后,為評價干酪乳桿菌胞外多糖對細胞過氧化氫損傷的保護作用,每個孔添加2 mL含終濃度為100 μmol/L的H2O2,終濃度為100、200、300和400 μg/mL的EPS無血清培養(yǎng)基混合物(以不用H2O2處理為對照組,以不加胞外多糖保護組做模型組)。培養(yǎng)24 h后,除去培養(yǎng)上清,取出細胞懸浮液,在1 mL的緩沖液(50 mmol/L的Tris-HCl pH 8.0、50 mmol/L EDTANa2、0.2 mol/L NaCl、1% Triton X-100)中裂解細胞,產生細胞勻漿,10000×g,4 ℃,離心15 min,取上清。檢測前上清液儲存在-20 ℃。

1.2.6.2 丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活力及總抗氧化能力(T-AOC)測定 使用MDA、SOD、T-AOC測定試劑盒進行測定。測定方法以及計算方式參照說明書進行。

按式(4)計算MDA含量計算公式:

式(4)

式中:A測為加入樣品的吸光度;A標為加入標準品(四乙氧基丙烷)的吸光度;A空為加入空白樣(無水乙醇)的吸光度;A對為用A空代替;據此可以計算出酶活性大小。

定義1 mL反應液中SOD抑制率達50%時所對應的SOD量為一個SOD活力單位(U),故按式(5)計算SOD活力計算公式為:

式(5)

式中:A測為加入樣品的吸光度;A對為加入對照品(雙蒸水)的吸光度。

總抗氧化能力定義為在37 ℃時,1 min 1 mL樣品使反應體系的吸光度值每增加0.01時,為一個總抗氧化能力單位(U),故按式(6)計算計算總抗氧化能力:

式(6)

式中:A測為加入體系、樣品,37 ℃水浴30 min的吸光度;A對為加入體系,37 ℃水浴30 min后加入樣品的吸光度。

1.3 數據處理

每組實驗重復3次,實驗結果為3次重復的平均值,采用SPSS 22.0軟件進行實驗數據的統計與分析。檢測水準為0.05,運用最小顯著差異(Least significant difference,LSD)法比較,以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 總糖量測定結果

本實驗采用苯酚-硫酸法測定所分離的胞外多糖產量,3號、5號、7號菌株的產量分別達(205.863±4.306)、(210.775±6.331)、(233.550±4.306) mg/L。李向菲等[22]根據產量將產胞外多糖乳酸菌分為高產(產量≥180 mg/L)、中產(180>產量≥120 mg/L)和低產(產量<120 mg/L)胞外多糖菌株。本研究這三株菌株胞外多糖產量都高于180 mg/L,根據劃分標準,這三株副干酪乳桿菌均為胞外多糖高產菌株。

2.2 DPPH·清除活性分析

抗壞血酸以及副干酪乳桿菌生物合成胞外多糖清除DPPH活性如圖1所示。3株副干酪乳桿菌生物合成胞外多糖均具有一定清除DPPH·的能力,且對清除DPPH·的能力均表現出濃度依賴的特征,對DPPH·清除率隨胞外多糖的濃度100～400 μg/mL逐漸增大,當胞外多糖濃度為400 μg/mL時,3號、5號、7號菌株胞外多糖對DPPH·清除率分別為6.55%、8.87%、8.80%(圖1B),但均低于抗壞血酸對DPPH·的清除率(圖1A)。Zhang等[14]對植物乳桿菌C88胞外多糖抗氧化性分析得到類似的結果,他們結果顯示胞外多糖對DPPH·清除活性隨其濃度增加而增加,當胞外多糖濃度達1.0 mg/mL時活性最大,進一步增加也不會顯著影響活性,當濃度為4.0 mg/mL時,其胞外多糖和抗壞血酸分別顯示出DPPH自由基清除活性為52.23%和88.60%;而張玉龍等[23]篩選出的8株產胞外多糖乳酸菌中,七株乳酸菌所產胞外多糖均比抗壞血酸的DPPH·清除能力強,并且其胞外多糖的DPPH·清除能力,最高可達11.93%±0.01%,是抗壞血酸的2倍。

圖1 抗壞血酸以及胞外多糖對DPPH·的清除活性Fig.1 Scavenging activity of VC and extracellular polysaccharide against DPPH·

2.3 ·OH清除活性分析

在本研究中,·OH來源于Fenton反應(Fe2++H2O2=Fe3++OH-+HO·),以亮綠作為顯色劑。胞外多糖對·OH的清除活性如圖2所示。隨著胞外多糖的濃度增加,清除率呈上升趨勢,并且具有明顯的劑量依賴關系。當胞外多糖濃度達400 μg/mL時,3號、5號、7號3株副干酪乳桿菌胞外多糖對自由基清除率分別為86.57%、82.59%、88.94%,均高于抗壞血酸的清除率(65.87%),這表明3株副干酪乳桿菌胞外多糖都具有強的·OH清除能力。Guo等[24]的研究結果也得到相同的結果,胞外多糖羥基自由基清除活性以濃度依賴的方式增加。另有研究表明,副干酪乳桿菌VL8所產胞外多糖在濃度于200 μg/mL時其胞外多糖的·OH清除率與抗壞血酸就已經基本持平(41%),并且隨著EPS濃度的增加其羥基自由基清除率也有所增長[13]。這體現出本研究所分離的3株副干酪乳桿菌EPS在·OH清除方面是具有一定潛力。

圖2 胞外多糖與VC對羥基自由基的清除活性Fig.2 Scavenging activity of extracellular polysaccharide and VC against hydroxyl radical

圖3 胞外多糖與VC超氧陰離子自由基清除活性Fig.3 Scavenging activity of extracellular polysaccharide and VC against superoxide anion free radical

2.5 胞外多糖緩解293T細胞氧化損傷能力評價

2.5.1 丙二醛(MDA)含量 丙二醛(MDA)是自由基攻擊膜不飽和脂肪酸的產物可以與蛋白質的游離氨基作用,引起蛋白質分子內和分子間交聯,導致細胞損傷[25],MDA含量越高說明細胞損傷越嚴重。本實驗的3號副干酪乳桿菌胞外多糖作用H2O2誘導的293T細胞的MDA含量的結果如圖4所示。將對照組293T細胞內MDA水平與模型組293T細胞(內MDA水平進行比較,在胞外多糖濃度100～400 μg/mL時,MDA的水平均有顯著的降低(P<0.05)。隨著胞外多糖濃度的升高,MDA水平呈逐步降低的趨勢,高濃度(400 μg/mL)胞外多糖處理導致MDA水平最低。MDA水平的逐漸降低,表明胞外多糖在一定程度上抑制了膜脂質過氧化,保護了細胞的脂質膜,阻斷了外界活性氧的侵入。有研究顯示植物乳桿菌的胞外多糖能夠抑制Caco-2細胞內MDA的形成,用胞外多糖處理后的胞內MDA水平顯著降低(P<0.05),并且具有劑量效應[14],這與本研究結果一致。

圖4 293T細胞MDA含量Fig.4 MDA content in 293T cells注:小寫字母不同代表差異顯著(P<0.05);圖5、圖6同。

2.5.2 超氧化物歧化酶(SOD)活力 超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)是一種源于生命體的活性物質,能專一地清除體內有害的自由基,以解除自由基氧化體內的某些組成成分而造成的機體損害,其活性的高低可間接反映組織中超氧自由基的含量和細胞受損程度[21]。胞外多糖作用于H2O2誘導的293T損傷細胞的SOD活性的結果如圖5所示。與對照組相比模型組SOD活性顯著降低,經過胞外多糖處理后SOD活性有所增加,并且隨著胞外多糖濃度的升高SOD活性逐步增大。同類研究中,Zhang[14]等在對植物乳桿菌C88胞外多糖抗氧化性的進一步研究顯示,將胞外多糖預處理24 h即可以恢復H2O2處理的Caco-2細胞的SOD活性,與氧化損傷模型細胞相比,高劑量的胞外多糖(100和200 μg/mL)能顯著提高SOD水平。白麗娟[26]利用瑞士乳桿菌SMN2-1的主要多糖組分EPS-S1處理D-半乳糖亞急性衰老小鼠模型,也發(fā)現當胞外多糖為100及200 mg/kg時能夠極顯著恢復肝臟以及腦組織中SOD活性(P<0.01)。這也表明了乳酸菌胞外多糖在抗氧化方面所具有的潛力。本實驗所用的胞外多糖能夠清除H2O2造成的自由基從而恢復SOD活性。

圖5 293T細胞SOD活性Fig.5 SOD activity in 293T cells

2.5.3 總抗氧化(T-AOC)能力 如圖6所示,將293T細胞用H2O2誘導損傷后,細胞的總抗氧化能力顯著降低(P<0.05),當用胞外多糖的處理之后,使得損傷細胞的總抗氧化能力得以逐步恢復,這表明胞外多糖對能夠緩解細胞的氧化損傷。在胞外多糖濃度為100、200、300和400 μg/mL時,對照組、模型組以及各多糖處理組的總抗氧化活性分別是1.480、0.575、1.069、1.480、1.932和2.056 U/mL。經過不同濃度的EPS孵育后T-AOC水平顯著提高(P<0.05)。從總抗氧化水平來看,高濃度(≥300 μg/mL)的EPS可以提高細胞的總抗氧化能力,陳佩等[27]研究了干酪乳桿菌對HepG2細胞抗氧化功能的影響,結果谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSHPx)和過氧化氫酶(catalase,CAT)活力分別提高了80%、30%和124%(P<0.05)。

圖6 293T細胞總抗氧化能力(T-AOC)Fig.6 Total antioxidant capacity(T-AOC)in 293T cells

總之,根據本研究中各氧化指標的檢測結果,我們認為可能是由于胞外多糖清除了部分自由基,并且能夠對細胞內的抗氧化系統起到輔助甚至促進的作用,保證其正常的運行,抵御H2O2對細胞的氧化損傷,使細胞得以修復。

3 結論

作為一種天然的抗氧化物質,乳酸菌胞外多糖具有巨大的開發(fā)潛力,本研究所探討的3株副干酪乳桿菌生物合成的胞外多糖在體內外均有一定的抗氧化能力。體外實驗中發(fā)現,胞外多糖對羥基自由基清除能力較好。而細胞實驗中發(fā)現,副干酪乳桿菌產胞外多糖作用于H2O2誘導氧化損傷的293T細胞,能夠顯著的提高SOD活性、總抗氧化能力并抑制丙二醛(MDA)的生成(P<0.05)?？傊?這3株株副干酪乳桿菌胞外多糖具有良好的抗氧化性,作為食品添加劑有較好的運用潛力,如何增強其抗氧化性能將是之后的研究方向。