陳文鳳，郭雅玲

（福建農(nóng)林大學(xué) 園藝學(xué)院，福建 福州 350002）

烏龍茶是六大茶類之一，以其天然濃郁的花果香型和醇厚回甘的品種韻味有別于其他茶類，兼具綠茶的清爽高香和紅茶的鮮濃醇厚，素以滋味醇厚、花香濃郁、品種繁多而聞名天下，有著“茶中香檳”的美譽(yù)。其制作工序?yàn)椋簲偳?、做青、殺青、揉捻、包揉、干燥。做青是形成烏龍茶?dú)特品質(zhì)的關(guān)鍵工序，也是奠定烏龍茶獨(dú)特香氣和滋味的基礎(chǔ)。

做青是搖青和靜置交替進(jìn)行的過(guò)程，做青過(guò)程相當(dāng)于機(jī)械伴隨水分脅迫的逆境條件，植物在逆境條件下體內(nèi)發(fā)生一系列的生理生化變化[1]。做青引起的機(jī)械損傷以及水分的適度散失，一方面刺激了細(xì)胞內(nèi)各種內(nèi)含物的轉(zhuǎn)化，另一方面也為離體葉片營(yíng)造了一個(gè)逆境環(huán)境，促使細(xì)胞內(nèi)發(fā)生微妙的變化，如細(xì)胞膜透性改變、多酚類物質(zhì)氧化、物質(zhì)水解、脂質(zhì)降解、葉綠素破壞等，這些變化為烏龍茶獨(dú)特品質(zhì)的形成奠定基礎(chǔ)[2]。

做青葉細(xì)胞內(nèi)部的研究主要集中在做青過(guò)程中細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化、酶活性變化、脂質(zhì)過(guò)氧化等[3-4]；近幾年，隨著茶樹分子生物學(xué)的快速發(fā)展，也展開(kāi)了對(duì)烏龍茶做青葉片內(nèi)部的分子機(jī)制的初步研究[5]。

1 烏龍茶葉片結(jié)構(gòu)的獨(dú)特性

制作茶葉，必須要講究茶鮮葉的適制性，制作烏龍茶的鮮葉要求表面角質(zhì)層和蠟質(zhì)層要厚，防止搖青后出現(xiàn)死青。嚴(yán)學(xué)成[6]對(duì)烏龍茶不同葉位的葉片進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)觀察，發(fā)現(xiàn)適制烏龍茶的茶樹品種鮮葉特征為：從芽下第一葉到第四葉，葉片內(nèi)的葉綠體結(jié)構(gòu)逐漸發(fā)生分化、葉綠體片層增多，葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量呈遞增趨勢(shì)，第三葉的葉綠體出芽產(chǎn)生原生質(zhì)體，并指出適制烏龍茶各品種的成熟葉普遍存在葉綠體出芽產(chǎn)生原生質(zhì)體的現(xiàn)象，這是適制烏龍茶鮮葉有別于適制其他茶類鮮葉的特性。

2 做青葉細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)變化

做青期間葉片發(fā)生碰撞，使葉片細(xì)胞組織損傷與器官發(fā)生變化。黃曉敏[7]對(duì)烏龍茶鮮葉與做青葉葉片顯微結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較研究，發(fā)現(xiàn)與鮮葉相比，做青葉片有水紋狀皺縮，葉脈下陷，葉表面粗糙，上表皮角質(zhì)層不清晰，下表皮細(xì)胞不完整，海綿組織更加疏松，表明做青使鮮葉內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。

3 做青葉細(xì)胞酶的變化

做青的目的是讓葉片內(nèi)發(fā)生適度的酶促氧化，促進(jìn)做青葉內(nèi)部物質(zhì)轉(zhuǎn)化與積累，逐步形成花香馥郁、滋味醇厚的內(nèi)質(zhì)和綠葉紅邊的葉底。做青葉內(nèi)的酶活性與做青程度密切相關(guān)，做青過(guò)程中的內(nèi)源酶活性直接影響成品茶品質(zhì)特征[8-9]。

3.1 氧化還原酶類

多酚氧化酶（PPO）和過(guò)氧化物酶（POD）是烏龍茶加工過(guò)程中重要的氧化還原酶類。

禹利君等[10]初步探明了烏龍茶做青葉片內(nèi)POD 和PPO 的變化規(guī)律，整葉中的PPO 活性在做青過(guò)程中呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，而POD活性則呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)；整葉、葉緣、葉芯這三者的PPO 和POD 活性變化規(guī)律不同，且PPO 與POD 的變化規(guī)律是相反的。黃福平等[11]進(jìn)一步推測(cè)了做青前期PPO 活性的增加并未明顯導(dǎo)致多酚類物質(zhì)下降的原因是做青前期細(xì)胞破損率和膜透性都很低，而在做青后期細(xì)胞質(zhì)膜通透性增加，使細(xì)胞內(nèi)的酶與底物充分接觸，促進(jìn)多酚類物質(zhì)氧化；并發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)膜透性過(guò)度加大會(huì)造成多酚類物質(zhì)與蛋白質(zhì)聚合沉積，不利于烏龍茶良好品質(zhì)的形成，指出以不導(dǎo)致做青葉細(xì)胞質(zhì)膜通透性急劇增大，引起多酚類物質(zhì)顯著下降為烏龍茶做青適度的生化指標(biāo)之一。

王爾茂等[12]進(jìn)行了不同做青方式對(duì)內(nèi)源酶的影響研究，發(fā)現(xiàn)POD、PPO 和SOD 活性變化趨勢(shì)較一致，總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，做青結(jié)束時(shí)POD 和PPO 的活性均高于做青前的活性，且手工搖青葉的酶活性顯著低于機(jī)械搖青葉的酶活性；SOD 的活性的變化雖然也是先上升后下降的趨勢(shì)，但是做青結(jié)束后的酶活性要低于做青前時(shí)的活性，這是因?yàn)樽銮嗳~細(xì)胞受到外力的脅迫使SOD 活性上升以清除自由基，但隨著搖青次數(shù)的增加，自由基大量上升，導(dǎo)致SOD 活性下降。他指出做青使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)遭到破壞，酶與底物的接觸程度影響著茶多酚氧化和其他生化反應(yīng)的程度，表明做青應(yīng)講究做青適度，過(guò)度做青不利于良好品質(zhì)的形成。

陳敏星[13]也研究了做青過(guò)程中做青葉片的PPO、POD 的活性變化，發(fā)現(xiàn)做青葉POD 活性在四搖前一直上升并達(dá)到最大，但到做青結(jié)束時(shí)活性降低，猜測(cè)可能是由于做青葉的含水率較低導(dǎo)致的；PPO 活性呈下降上升下降上升的“W”型變化；做青后PPO 和POD 的活性均高于做青前，這與前人研究結(jié)果一致。

3.2 水解酶類

3.2.1 蛋白酶

蛋白酶是一種內(nèi)源水解酶，可將茶葉中的蛋白質(zhì)水解成各種氨基酸[14]。王若仲等[15]研究發(fā)現(xiàn)做青可增加葉片內(nèi)蛋白酶的活性，使葉片內(nèi)的可溶性蛋白和氨基酸含量增加。做青前中期，蛋白酶活性葉緣＞整葉＞葉芯；做青結(jié)束時(shí)，蛋白酶活性葉緣＞葉芯＞整葉。通過(guò)做青工藝，適當(dāng)?shù)恼{(diào)控蛋白酶活性，將有利于可溶性蛋白和游離氨基酸的適度積累，促進(jìn)烏龍茶優(yōu)良品質(zhì)的形成。

3.2.2 果膠酶

果膠酶的主要作用是分解植物組織細(xì)胞壁和細(xì)胞間的果膠物質(zhì)，進(jìn)而使細(xì)胞壁解體并增加細(xì)胞間的通透性，促進(jìn)植物組織呼吸作用和物質(zhì)代謝[16]。唐顥[17]對(duì)金萱和白葉單樅做青過(guò)程中內(nèi)源果膠酶活性的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行研究，結(jié)果表明：搖青處理酶活性顯著高于不搖青處理，搖青前期酶活性逐漸增強(qiáng)，在第三次搖青結(jié)束時(shí)達(dá)到峰值，且可溶性糖的含量在此期間積累，使得葉質(zhì)變軟，降低了做青葉之間的摩擦強(qiáng)度，保證做青葉能夠順利“走水”，為后續(xù)的可溶性糖的轉(zhuǎn)化保留以及其他品質(zhì)生化成分的保留奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。此后的第四、五次搖青酶活性迅速下降，可能與在制品內(nèi)含物轉(zhuǎn)化和呼吸代謝有關(guān)。

3.2.3 β-葡萄糖苷酶

β-葡萄糖苷酶是烏龍茶香氣前體物質(zhì)釋放過(guò)程中的一種重要水解酶，其活性的變化直接影響著制茶品質(zhì)尤其是香氣品質(zhì)的形成[18-21]。張秀云[22]等研究了萎凋做青過(guò)程中β-葡萄糖苷酶活性的變化，結(jié)果表明，萎凋做青期間β 葡萄糖苷酶活性呈盤峰變化趨勢(shì)，做青結(jié)束前約2 h達(dá)到整個(gè)做青過(guò)程的巔峰值；做青后期，β-葡萄糖苷酶活性下降，推測(cè)可能是因?yàn)樵谂R近做青結(jié)束時(shí)，茶鮮葉失水較多、細(xì)胞膜透性增大、多酚類物質(zhì)的酶促氧化作用增強(qiáng)，氧化還原酶的強(qiáng)活性抑制了水解酶的活性，導(dǎo)致β-葡萄糖苷酶活性降低。陳藝元[23]也對(duì)搖青工藝中的酶活性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)搖青可以提高酶的活性，機(jī)械力使細(xì)胞內(nèi)的液泡損傷，促進(jìn)液泡中的糖苷類前體與β-葡萄糖苷酶接觸，酶活性的峰值出現(xiàn)在第一次和第二次搖青完成時(shí)，隨后晾青過(guò)程中活性下降，此研究結(jié)果與張秀云的研究結(jié)果基本一致。吳喬[24]等的研究結(jié)果表明，β-葡萄糖苷酶的活性在低溫（17℃）條件下被抑制；高溫（27℃）雖然能促進(jìn)β-葡萄糖苷酶活性的增加，但葉片內(nèi)呼吸作用的增強(qiáng)會(huì)增加內(nèi)含物質(zhì)的消耗，不利于烏龍茶良好品質(zhì)的形成；室溫22℃不僅能增加酶活性，而且也能保證做青的品質(zhì)。做青引起的機(jī)械損傷以及水分的適度散失，一方面刺激了細(xì)胞內(nèi)各種內(nèi)含物質(zhì)的轉(zhuǎn)化，提高了β-葡萄糖苷酶的活性；另一方面，這種損傷不至于造成細(xì)胞死亡，反而通過(guò)搖青的“走水還陽(yáng)”作用維持了細(xì)胞的活力，使細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)轉(zhuǎn)化和呼吸作用得到合理控制。

3.2.4 纖維素酶

纖維素酶可使細(xì)胞壁降解，從而促進(jìn)細(xì)胞間的物質(zhì)、水分轉(zhuǎn)運(yùn)和酶促反應(yīng)進(jìn)行。唐顥等[25]對(duì)做青期間纖維素酶活性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)做青葉纖維素酶活性高于不做青葉纖維素酶活性，做青葉在二搖前，纖維素酶活性上升快，且可溶性糖含量增加，但隨著搖青次數(shù)的增加，纖維素酶活性減弱，這可能是由于細(xì)胞受損增加，多酚類物質(zhì)增多，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)沉淀增加，導(dǎo)致酶活性下降?？梢酝茢嘧銮嗲捌冢w維素酶活性的增加為可溶性糖的積累提供物質(zhì)基礎(chǔ)，參與烏龍茶滋味品質(zhì)的形成。

4 做青過(guò)程中脂質(zhì)過(guò)氧化

植物在正常生長(zhǎng)條件下，體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和清除處于動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)處于各種逆境脅迫時(shí)這種平衡被破壞，引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化，導(dǎo)致細(xì)胞流動(dòng)性和通透性發(fā)生改變。

黃福平等[26]等研究結(jié)果表明，搖青和自然萎凋均能促進(jìn)膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物（丙二醛MDA）積累。陳敏星[13]研究結(jié)果表明梅占做青葉在三搖前MDA 含量一直下降，三搖后直到做青結(jié)束，MDA 含量持續(xù)上升。溫立香[27]等研究發(fā)現(xiàn)，水分與脂質(zhì)過(guò)氧化極顯著正相關(guān)，做青葉片隨著做青進(jìn)程的增加，其細(xì)胞內(nèi)部的MDA 含量和自由基H2O2含量持續(xù)上升。

5 線粒體的變化

線粒體是細(xì)胞中產(chǎn)生活性氧的一個(gè)重要部位，是細(xì)胞凋亡的調(diào)控中心，在細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用[28-30]。植物細(xì)胞凋亡主要包括植物自身發(fā)育過(guò)程中的細(xì)胞凋亡和環(huán)境作用影響的細(xì)胞凋亡[31]。逆境條件下，當(dāng)線粒體膜受到損傷時(shí)，膜電位就會(huì)降低，線粒體膜上的通透性轉(zhuǎn)化（MPT）現(xiàn)象是線粒體結(jié)構(gòu)功能發(fā)生改變的重要分子機(jī)制[32-33]。

溫立香[27]研究了烏龍茶做青過(guò)程中線粒體的理化變化，發(fā)現(xiàn)葉片線粒體膜吸光度從鮮葉至做青結(jié)束逐漸下降，說(shuō)明搖青刺激細(xì)胞內(nèi)線粒體膜通透性轉(zhuǎn)化（MPT）的發(fā)生；烏龍茶做青過(guò)程中葉片線粒體中的MDA 和H2O2含量都逐漸增加，說(shuō)明了做青導(dǎo)致葉片線粒體被活性氧毒害。

目前對(duì)于烏龍茶做青過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)是否會(huì)發(fā)生凋亡現(xiàn)象及與凋亡密切相關(guān)的線粒體的變化方面研究鮮少，但在其他植物上的研究已有報(bào)道[34-35]，做青相當(dāng)于一個(gè)逆境脅迫的過(guò)程，可參考已有逆境對(duì)細(xì)胞變化影響的研究，將其運(yùn)用在做青葉內(nèi)部微觀的細(xì)胞學(xué)研究上，從而揭示烏龍茶做青的內(nèi)在機(jī)理。

6 烏龍茶做青過(guò)程基因表達(dá)

6.1 GGDPS 基因

牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶（Geranyl geranyl diphosphate synthase，GGDPS），是植物萜類物質(zhì)合成途徑中的關(guān)鍵酶之一。姚雪倩等[36]等克隆出鐵觀音CsGGDPS 基因并利用實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)檢測(cè)該基因在做青過(guò)程中的表達(dá)模式。結(jié)果表明，從鮮葉到曬青葉，該基因表達(dá)量較低且增長(zhǎng)較慢，但隨著搖青的進(jìn)程表達(dá)量顯著增加，且在殺青前表達(dá)量達(dá)到最高，約為鮮葉的20倍，推測(cè)該基因參與烏龍茶萜烯類香氣品質(zhì)形成。

6.2 CsID 基因

陳丹[37]等克隆與萜類化合物形成相關(guān)的異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶（CsIDI1 和CsIDI2）并利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)檢測(cè)此基因在做青過(guò)程中的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)做青過(guò)程中，CsIDI1 和CsIDI2 基因表達(dá)量上升，這與前人的研究結(jié)果一致，表明CsIDI1 和CsIDI2 基因在烏龍茶做青過(guò)程中受到脅迫促進(jìn)萜類香氣物質(zhì)的形成。

6.3 CsMVK 基因

王鵬杰[38]等克隆出與萜類化合物形成相關(guān)的酶基因（CsMVK 基因）并實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測(cè)此基因在做青過(guò)程中的表達(dá)特性，發(fā)現(xiàn)烏龍茶在做青過(guò)程中，CsMVK 基因在曬青到一搖過(guò)程表達(dá)量下降，但經(jīng)過(guò)3 次搖青，表達(dá)量在殺青前達(dá)到最大值，推測(cè) CsMVK 基因在做青過(guò)程中受到機(jī)械力的損傷使其表達(dá)增加，參與茶葉萜類香氣物質(zhì)的形成，這也與前人研究的做青期間可促進(jìn)香精油的積累相符[39-40]。

6.4 CsTPS 基因

單萜合成酶（monoterpene synthases, mono,TPs）是植物單萜化合物合成途徑的限速酶。王鵬杰[41]等克隆了CsTPS 基因并利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)研究該基因在烏龍茶做青過(guò)程中的表達(dá)模式，結(jié)果表明，該基因從鮮葉到曬青階段表達(dá)量顯著增加，曬青葉的表達(dá)量是鮮葉的3倍，一搖二搖后表達(dá)量下降，三搖和殺青前期表達(dá)量顯著上升，且殺青前期表達(dá)量是鮮葉的3.8倍，推斷該基因參與烏龍茶香氣品質(zhì)的形成。

6.5 CsNCED 基因

做青過(guò)程相當(dāng)于茶樹葉片處于逆境脅迫的過(guò)程，脫落酸在植物逆境脅迫響應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。9-順式環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶NCED是植物ABA 生成的關(guān)鍵酶，王贊[42]等克隆出與調(diào)控ABA 含量密切相關(guān)的鐵觀音CsNCED2基因，并實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)此基因在烏龍茶做青過(guò)程中的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)從鮮葉到曬青結(jié)束，CsNCED2 表達(dá)量顯著增加并達(dá)到第一個(gè)峰值，之后的搖青其表達(dá)量下降，到殺青前，CsNCED2 表達(dá)量顯著上升，達(dá)到最高。說(shuō)明做青過(guò)程此基因表達(dá)量顯著增加，激發(fā)了以ABA含量為基礎(chǔ)的氣孔開(kāi)閉和脅迫氧化應(yīng)激反應(yīng)。Cho 等研究發(fā)現(xiàn)NCED 在做青過(guò)程中表達(dá)存在顯著差異[43]。

7 展望

目前對(duì)烏龍茶做青過(guò)程中葉片的研究主要集中在葉片的生化成分、葉片內(nèi)的酶、香氣、脂質(zhì)過(guò)氧化等的研究上，但對(duì)于做青過(guò)程中與品質(zhì)形成相關(guān)的分子研究尚處于初始階段。近幾年，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，對(duì)于烏龍茶品質(zhì)形成的分子機(jī)制研究需要深入到細(xì)胞或亞細(xì)胞水平上，更精確地去探明烏龍茶品質(zhì)形成的內(nèi)部調(diào)控機(jī)制[44-45]。隨著科學(xué)技術(shù)手段的提升與發(fā)展，烏龍茶做青將從宏觀的工藝研究轉(zhuǎn)向微觀的細(xì)胞學(xué)研究，深入探究烏龍茶做青與品質(zhì)關(guān)系的內(nèi)在機(jī)理，為烏龍茶做青的技術(shù)經(jīng)驗(yàn)提供理論支持，也為烏龍茶工藝優(yōu)化、品質(zhì)提高和高效生產(chǎn)奠定理論基礎(chǔ)[46]。