朱晁誼，朱牧孜，李 爽

(1.華南理工大學 生物科學與工程學院，廣東 廣州 510006；2.廣東省微生物研究所 省部共建華南應(yīng)用微生物國家重點實驗室 廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點實驗室 廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實驗室，廣東 廣州 510070)

近年來，隨著合成生物學的快速發(fā)展，通過基因工程及代謝工程構(gòu)建微生物細胞工廠生產(chǎn)高附加值化合物變得極具吸引力。盡管微生物細胞工廠在化工、食品、制藥、醫(yī)療和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域已取得諸多成果，如已處于商業(yè)規(guī)模生產(chǎn)的1,4-丁二醇(1,4-butanediol)[1]和重要藥物前體青蒿酸(artemisinic acid)[2]，但獲得適用于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)的高產(chǎn)菌種仍是目前一大難題[3]。微生物細胞生長及生產(chǎn)往往涉及多種表型的協(xié)調(diào)優(yōu)化，受多個基因及環(huán)境因素相互作用的影響，即使以基因背景充分解析的微生物為宿主，依然存在許多不可預(yù)測的因素，限制了人們對微生物工廠的合理設(shè)計。因為微生物普遍具備遺傳與變異的進化特性，所以讓微生物通過進化自主完成系統(tǒng)表型優(yōu)化，實現(xiàn)目標化合物的高產(chǎn)，是21世紀由石油化工向生物化工轉(zhuǎn)型過程中科學研究的一大熱點。

1 微生物自適應(yīng)實驗室進化

一般來說，微生物在適應(yīng)環(huán)境過程中，菌體必然會發(fā)生變異，改變某些表型，這是進化的必然趨勢。在該理論的支持下，微生物自適應(yīng)實驗室進化(adaptive laboratory evolution,ALE)應(yīng)運而生。ALE是指通過施加人為干擾及控制微生物生長環(huán)境實現(xiàn)微生物進化。與代謝工程相比，ALE不需要考慮菌體錯綜復(fù)雜、相互交叉的代謝網(wǎng)絡(luò)，只需根據(jù)目標設(shè)計對應(yīng)的干擾因素，具有微生物適用性廣泛及實用性強的優(yōu)點，易于發(fā)現(xiàn)新機制、實現(xiàn)表型優(yōu)化[4]。

自20世紀末開始，越來越多的學者使用ALE技術(shù)改造菌株以實現(xiàn)所需的功能。Caspetal等[5]通過對S.cerevisiaeCEN.PK113-7D實行ALE實驗以篩選耐熱性菌株，在39.5 ℃條件下連續(xù)傳代超過300代，最終突變株在40 ℃條件下的比生長速率提高了1.57倍，乙醇與甘油的產(chǎn)量分別提高了1.6和1.3倍。菌株全基因組測序及轉(zhuǎn)錄組測序分析表明，酵母耐熱性提高與固醇合成途徑某些基因的突變及表達增加有關(guān)。筆者所在的課題組的Zhu等[6]和Yang等[7]也曾利用ALE實驗對2株經(jīng)代謝工程改造過的嗜熱厭氧桿菌T.aotearoenseSCUT27進行了高濃度底物耐受進化實驗，產(chǎn)乙醇突變株SCUT27/Δldh和產(chǎn)乳酸突變株LA1002分別在梯度增加碳源的培養(yǎng)基中經(jīng)過58和40次傳代；在5 L發(fā)酵罐研究中，突變株SCUT27/Δldh-G58比出發(fā)菌株的遲滯期縮短75 h，乙醇產(chǎn)量提高了1.6倍；LA1002-G40在48 h內(nèi)完全發(fā)酵含100 g/L糖的廚余水解液，乳酸產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率分別達68.03 g/L和0.79 g/g，而LA1002未見生長。最后，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和胞內(nèi)溶質(zhì)研究顯示，高滲透壓環(huán)境促使嗜熱厭氧桿菌調(diào)控自身UDP-glucose代謝、氨基酸代謝等多個通路，使可作為滲透壓保護劑的谷氨酸(Glu)和甘氨酸(Gly)等氨基酸胞內(nèi)的含量增加了1.42～2.90倍，并上調(diào)了應(yīng)對環(huán)境壓力的DNA修復(fù)相關(guān)基因的表達。這充分說明了ALE實驗在實現(xiàn)菌株定向進化方面的便捷性和有效性。

在具體實踐中，ALE實驗以特定的選擇壓力為基準篩選表型增強的突變體，多應(yīng)用于提高工業(yè)菌種在不同生產(chǎn)條件下的穩(wěn)定性及耐受性，如溫度耐受性[5]、離子液體耐受性[8]及有效利用次優(yōu)碳源[9]等。然而，在獲得高產(chǎn)化合物的進化研究中，由于化合物的生產(chǎn)通常會加重細胞負擔或產(chǎn)生細胞毒性，這種傳統(tǒng)的ALE實驗方法往往出現(xiàn)相反的結(jié)果[10]。因此，在提高化合物產(chǎn)量的進化研究中，將目標化合物的生產(chǎn)與微生物生長耦聯(lián)起來，是目前應(yīng)用ALE實驗的一種有效方法。Reyes等[11]利用類胡蘿卜素具有抗氧化的特性，刪除了酵母細胞體內(nèi)正常清除活性氧(ROS)的途徑而使得類胡蘿卜素成為細胞抵御ROS的主要來源，通過周期性施加過氧化氫刺激的方法進行ALE實驗，最終類胡蘿卜素產(chǎn)量提高約3倍。

2 提高微生物實驗室進化速度的策略

ALE實驗可不需要預(yù)先產(chǎn)生目標基因的突變庫，通過施加環(huán)境壓力促進微生物進化，但微生物自發(fā)突變率很低，需要通過長期傳代培養(yǎng)以富集突變。因此，為提高微生物進化速度，通常需增加出發(fā)菌株的基因多樣性。

基因多樣性可以通過多種方法產(chǎn)生，從完全無靶向的全基因組誘變到針對特定基因的完全靶向方法，皆有文獻報道。早期研究中，常使用增變菌株為宿主(如E.coliXL1-Red，其全基因組突變率為野生型菌株的5 000倍)[12]，利用紫外誘變或化學誘變[13]構(gòu)建突變庫等方法建立基因多樣性，但其不穩(wěn)定性及無目的全靶向等弊端限制了其大范圍使用。

近年來，比起完全無靶向的全基因誘變或?qū)δ康幕蛏钊肓私獾娜邢蛲蛔兎椒?，連續(xù)定向進化方法更受廣大學者青睞，其最重要的一個特征是能以這一種不會擾亂宿主生長的方式調(diào)節(jié)目的基因進行進化[14]。以下介紹將突變局限于目標基因的定向進化方法(體外或體內(nèi)構(gòu)建突變體)，很大程度地避免宿主其他基因的突變。

2.1 體外構(gòu)建突變庫

在體外采取隨機突變產(chǎn)生目的基因突變庫是一種較為有效的半靶向方法，如易錯傾向的PCR(error-prone PCR,epPCR)[15]。這種基于PCR的方法利用低保真DNA聚合酶可快速構(gòu)建基因突變庫，經(jīng)濟省時，但低保真DNA聚合酶傾向于產(chǎn)生特定類型的突變，導(dǎo)致epPCR突變庫產(chǎn)生某種偏向性，縮小了突變庫的有效規(guī)模。目前，可以通過改變PCR反應(yīng)中dNTPs的比例或使用多種不同偏向的易錯DNA聚合酶來克服該缺點。此外，一些常規(guī)的體外構(gòu)建突變庫的方案，如DNA shuffling等可以詳細參考相關(guān)綜述[16]。

近年來，體內(nèi)位點特異性突變及自動化技術(shù)的進步為微生物持續(xù)定向進化提供了機遇[17-18]，在初步了解與表型相關(guān)基因組區(qū)域的情況下，這些方法可有效規(guī)避隨機突變的偏向性及不可控性等問題。

Wang等[19]成功開發(fā)出多重自動化基因工程技術(shù)(multiplexed automated genome engineering,MAGE)，如圖1(a)所示，通過單鏈DNA(single-stranded DNA,ssDNA)實現(xiàn)E.coli染色體上多位點的同時突變，實現(xiàn)基因組合多樣性。通過改造E.coli的限制修飾系統(tǒng)，引入噬菌體的λ-Red ssDNA結(jié)合蛋白β，大大提高ssDNA的整合效率，并通過自動化裝置實現(xiàn)快速連續(xù)定向進化。應(yīng)用這套系統(tǒng)優(yōu)化E.coliEcNR2的1-脫氧-d-木酮糖-5-磷酸鹽(DXP)合成途徑生產(chǎn)番茄紅素，針對DXP途徑中的24個基因，設(shè)計一系列特異性突變的ssDNA，利用MAGE技術(shù)連續(xù)隨機整合至宿主染色體，每天可創(chuàng)造超過43億個的突變體，并在3 d內(nèi)使番茄紅素產(chǎn)量提高超過5倍。MAGE技術(shù)自首次實現(xiàn)多基因位點的快速突變以來，目前已多次成功用于大腸桿菌的代謝途徑優(yōu)化[20-21]，并有學者將此方法用于釀酒酵母中，演化出酵母寡聚核苷酸介導(dǎo)的基因工程技術(shù)(yeast oligo-mediated genome engineering,YOGE)[22]。

CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic rep)系統(tǒng)的問世大大方便了生物基因組的靶向編輯，同時也被學者們研究發(fā)展應(yīng)用于定向進化中。Ronda等[23]將CRISPR-Cas9與MAGE技術(shù)結(jié)合創(chuàng)造了CRMAGE技術(shù)，將重組效率由0.68%～5.4%提高至96.5%～99.7%，大大提高了進化效率。此外，Gill課題組的Garst等[24]開發(fā)了一套CRISPR激活的可追蹤基因工程技術(shù)(CRISPR-enabled trackable genome engineering,CREATE)，如圖1(b)所示，該系統(tǒng)關(guān)鍵在于構(gòu)建包含gRNA與同源修復(fù)片段的CREATE表達盒，既完成位點突變，實現(xiàn)基因組的多樣性，也充當追蹤標記，篩選完成后快速發(fā)現(xiàn)基因型與表型間的聯(lián)系。此后，Gill課題組的Liang等[25]將此技術(shù)應(yīng)用于提高E.coli異源生產(chǎn)異丙醇中，在常規(guī)實驗室條件下，不依賴全基因組測序，幾天內(nèi)生成并鑒定了近千個單基因和多基因組合突變體，最終獲得異丙醇產(chǎn)率提高3倍的E.coli突變菌株。

2.2 體內(nèi)構(gòu)建突變庫

前述的方法均是在ALE實驗前獲得基因多樣性，如果能夠在ALE實驗過程中獲得基因多樣性而不影響宿主菌株的正常生長，可簡化操作、減少人為干擾，更有利于實現(xiàn)定向進化的連續(xù)性。

2011年，Esvelt等[26]開發(fā)的噬菌體輔助連續(xù)進化技術(shù)(phage-assisted continuous evolution,PACE)(圖2(a))，將目的蛋白活性與噬菌體的生命周期耦聯(lián)，在恒化連續(xù)裝置的輔助下，8 d內(nèi)實現(xiàn)無人為干擾的目標蛋白質(zhì)200代進化。整套系統(tǒng)利用噬菌體M13的增殖依賴于pIII蛋白這一特性，將需進化的目的基因替換原來的pIII蛋白基因，構(gòu)建1個含目的基因的pIII蛋白缺陷型的選擇噬菌體(selection phage,SP)，而宿主E.coli則包含2個主要質(zhì)粒：輔助質(zhì)粒(accessory plasmid,AP)和致突變質(zhì)粒(mutagenesis plasmid,MP)。AP主要包含與目的基因活性相耦聯(lián)的pIII蛋白基因，SP必須進化出有活性的突變，才可啟動AP上pIII蛋白表達，噬菌體才可獲得增殖能力并持續(xù)侵染其他宿主，實現(xiàn)連續(xù)進化。而MP則含有4個dnaQ926、umuC、umuD′和recA730受阿拉伯糖調(diào)控的基因，經(jīng)誘導(dǎo)可產(chǎn)生隨機突變，提高整個系統(tǒng)的突變率。此外，為了將作用于所有基因的隨機突變限制于噬菌體的目的基因處，他們引入恒化器裝置，流入新鮮的宿主細胞，并設(shè)置流出速度稍快于宿主的復(fù)制速度，故只有獲得有益突變從而完成增殖的噬菌體可以持續(xù)侵染新宿主，在恒化器中富集，而無法實現(xiàn)突變完成增殖的噬菌體則最終會流失。利用這套系統(tǒng)可進化任何與pIII蛋白表達耦聯(lián)的蛋白，而目前將酶的多種功能與報告蛋白的表達相耦聯(lián)的研究進展為PACE技術(shù)應(yīng)用于多種蛋白或酶的改造提供了可能。目前該技術(shù)已應(yīng)用于RNA聚合酶[27]、aminoacyl-tRNA合成酶[28]或毒素[29]等蛋白的進化研究中。

盡管PACE在連續(xù)定向進化蛋白質(zhì)方面有突出的貢獻，但目前它的宿主只限于大腸桿菌，無法用于酵母等真核生物。2016年，Crook等[30]建立了一套以轉(zhuǎn)座子為基礎(chǔ)的酵母體內(nèi)定向進化方法(invivocontinuous evolution,ICE)(圖2(b))。ICE系統(tǒng)的關(guān)鍵在于易錯傾向的Ty1逆轉(zhuǎn)錄酶。具體來說，整合至Ty1逆轉(zhuǎn)錄識別區(qū)域的目的基因首先被轉(zhuǎn)錄，接著易錯傾向的Ty1逆轉(zhuǎn)錄酶表達并逆轉(zhuǎn)錄目的基因形成cDNA，產(chǎn)生基因多樣性之后，Ty1整合酶再將其重新整合至基因組上，完成一輪突變。這套利用逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子進行體內(nèi)誘變的系統(tǒng)可以擴展到任何支持LTR逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子活性的真核生物內(nèi)，宿主應(yīng)用范圍廣泛，他們應(yīng)用這套系統(tǒng)增強轉(zhuǎn)錄因子SPT15對1-丁醇的耐受性，改變脫羧酶的底物特異性，提高木糖分解途徑通量，展示出ICE系統(tǒng)對轉(zhuǎn)錄因子、單酶甚至多酶途徑進化的高效可行性。

利用正交復(fù)制的突變質(zhì)粒來實現(xiàn)靶基因突變也是目前較受歡迎的一種方法，這種方法最大的特點就是幾乎不改變宿主基因組，不影響宿主的正常生長，適合于酶的進化。這一策略最早期是由Fabret 等[31]在大腸桿菌中實現(xiàn)，他們利用DNA聚合酶Ⅰ(DNA PolⅠ)在細胞內(nèi)優(yōu)先復(fù)制質(zhì)粒上的基因且只復(fù)制染色體一小部分的特點，構(gòu)建低保真度的DNA PolⅠ突變體，完成質(zhì)?；虻耐蛔兌挥绊懰拗骰?。后來，Camp等[32]進一步增強了DNA PolⅠ的錯配率，實現(xiàn)TEMβ-內(nèi)酰胺酶的連續(xù)進化。除了在大腸桿菌中應(yīng)用，這種策略后來還被Liu Chang課題組的Ravikumar等[33-34]推廣至釀酒酵母的靶向突變中，他們在釀酒酵母中建立1個由正交DNA質(zhì)粒-DNA聚合酶對組成的細胞核外復(fù)制機制，并通過構(gòu)建易錯傾向的DNA聚合酶建立一套獨立于宿主的體內(nèi)連續(xù)進化系統(tǒng)(OrthoRep)，其體內(nèi)質(zhì)粒突變率是宿主基因組的10萬倍(圖2(c))。此后，Ravikumar等[34]借助此系統(tǒng)，在釀酒酵母中對惡性瘧原蟲來源的二氫葉酸還原酶(PfDHFR)進行連續(xù)進化，最終獲得對乙胺嘧啶耐受性提高4萬倍的突變體。最近，Liu Chang課題組的Arzumanyan等[35]對此系統(tǒng)進一步發(fā)展，在1個細胞中構(gòu)建了pGKL1質(zhì)粒/TP-DNAP1聚合酶對與pGKL2質(zhì)粒/TP-DNAP2聚合酶對2個彼此正交的DNA復(fù)制系統(tǒng)，這樣一對正交復(fù)制系統(tǒng)通過調(diào)節(jié)2個聚合酶的錯配率，實現(xiàn)體內(nèi)多基因的不同速率的進化。

除了用于正交質(zhì)粒上的靶基因的連續(xù)進化，將易錯傾向的DNA聚合酶用于基因組上任意靶基因的突變將更具應(yīng)用價值。最近，美國加州大學的Halperin等[36]將易錯DNA聚合酶與CRISPR技術(shù)相結(jié)合，構(gòu)建了一種名為“EvolvR”的體內(nèi)進化系統(tǒng)(圖2(d))。該系統(tǒng)將只產(chǎn)生單鏈斷裂的nCas9蛋白突變體與易錯傾向的缺口DNA聚合酶突變體融合，由gRNA引導(dǎo)至特定靶序列，隨后nCas9蛋白切割產(chǎn)生單鏈缺口，易錯的DNA聚合酶從缺口處開始補上新的核苷酸，替換下游的核苷酸，對靶基因生成一系列突變體，在1 d內(nèi)完成整個進化過程。一方面通過CRISPR系統(tǒng)規(guī)定了靶基因突變的起始位點，并以多組gRNA的共表達實現(xiàn)對基因組上多個靶位點的同時進化；另一方面通過調(diào)節(jié)DNA聚合酶突變體的持續(xù)合成能力、保真度及錯誤插入偏好性，從而相應(yīng)地控制靶基因的突變序列長度、突變率及核苷酸替代偏好，由此，理論上可實現(xiàn)所有物種的任意多個靶基因的體內(nèi)持續(xù)進化。

圖2 體內(nèi)構(gòu)建突變庫示意圖Fig.2 Schematic diagram of in vivo targeted mutagenesis

將現(xiàn)有的微生物實驗進化策略的詳細內(nèi)容進行總結(jié)，見表1。

3 連續(xù)自動化培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展

事實上，不管是近年來發(fā)展迅猛的連續(xù)定向進化策略還是早期依賴環(huán)境選擇壓力的適應(yīng)性進化方法，皆是基于微生物連續(xù)繁殖、富集突變而獲得特定表型的進化過程。微生物的連續(xù)培養(yǎng)繁殖主要是通過手動連續(xù)稀釋或自動化培養(yǎng)裝置實現(xiàn)的，前者容易出現(xiàn)種群瓶頸、培養(yǎng)密度波動及選擇壓力不均勻等問題；而后者的應(yīng)用卻常遇到生物膜積累、培養(yǎng)環(huán)境受限及高成本等阻礙，因此在推動微生物實驗室進化的進程中，連續(xù)自動化技術(shù)的發(fā)展尤為重要。

為解決生物膜積累的問題，de Crecy等[37]開發(fā)了一種叫“Evolugator”的連續(xù)進化裝置，在生物反應(yīng)器中設(shè)置不同隔離分區(qū)，以與動態(tài)控制器相連的濁度計的測量值來調(diào)節(jié)培養(yǎng)物的循環(huán)，達到減少生物膜形成和抑制貼壁生長的目的。利用這個平臺，研究人員在4個月內(nèi)成功進化出2株耐高溫的昆蟲病原真菌突變株，廣泛應(yīng)用于害蟲防治[38]。

隨著低成本及人性化的培養(yǎng)設(shè)備的研發(fā)，一些適用于小實驗室的連續(xù)自動化裝置漸漸發(fā)展起來，如Matteau等[39]設(shè)計的多功能連續(xù)培養(yǎng)裝置(versatile continuous culture device,VCCD)、Takahashi等[40]設(shè)計的具有開發(fā)資源的多路復(fù)用恒濁器(Flexostat)及Hoffmann等[41]設(shè)計的基于擴展卡爾曼濾波器原理估計細胞增長率的低成本恒濁器等，這些裝置皆具有由3D打印或易于操作的部件制成、受開放資源的軟件控制的特點。

此外，近幾年液體處理機器人[42]、微型恒化器陣列[43]及微液滴恒化器[44]等的出現(xiàn)，推動了連續(xù)自動化裝置與高通量平行化培養(yǎng)篩選策略的結(jié)合，在微生物實驗室進化過程中對選擇參數(shù)、突變率及突變范圍實現(xiàn)更高程度的控制，并一定程度上限制了人為干預(yù)。最近，Wong等[45]開發(fā)了一種名為“eVOLVER”的可任意縮放及實現(xiàn)用戶自定義的裝置，其開源的濕件、軟件及硬件等高度模塊化，可實現(xiàn)快速重新配置以適應(yīng)幾乎所有的自動化連續(xù)培養(yǎng)實驗，實現(xiàn)實驗室進化過程中自動化培養(yǎng)過程的高度可控性及高通量性的平衡。

表1 微生物實驗室進化策略的對比

4 總結(jié)

實驗室定向進化大大加速了人類改造蛋白質(zhì)、代謝途徑甚至細胞的步伐，在發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)新功能、提高酶活性及提升微生物細胞工廠產(chǎn)能等研究中具有應(yīng)用潛力。連續(xù)進化方法，可有效打破基因突變范圍、篩選能力及突變率等傳統(tǒng)進化方法的遺傳瓶頸，大幅度減少人為操作，為同時進行多個平行進化實驗提高可行性，也減少人為因素帶來的實驗誤差，大大推動了微生物實驗室進化的發(fā)展。

體內(nèi)連續(xù)進化方法也有其自身的缺陷，如連續(xù)培養(yǎng)過程中逃逸篩選的無效突變菌株的擴增、對自動化設(shè)備的高度依賴等，故體內(nèi)連續(xù)進化應(yīng)與其他實驗室進化方法相互補充，而非簡單替代。目前計算機輔助的體外進化設(shè)計技術(shù)的普及[46-48]、生物分子功能與報告分子或細胞生長耦聯(lián)技術(shù)的廣泛研究[49-50]及連續(xù)自動化技術(shù)的進步等，將為充分實現(xiàn)微生物實驗室進化的潛力發(fā)揮出關(guān)鍵作用。