李辛雷，王 潔，殷恒福，范正琪，李紀元

(中國林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所，浙江 杭州 311400)

金花茶(Camellianitidissima)為國家一級珍稀瀕危植物[1]，其天然種群主要分布于我國廣西南寧及防城港市的防城區(qū)和東興市等[2]。現(xiàn)有茶花品種多為白色、粉色和紅色，缺少黃色，而金花茶花朵金黃色，具蠟質(zhì)光澤，是培育黃色茶花的優(yōu)良親本。金花茶花朵和葉片中含有類黃酮、茶多酚及茶多糖等多種活性成分，具有降血糖、降血脂、降血壓和抗腫瘤等藥理功效[3]。因此，積極開展珍稀瀕危植物金花茶的保護遺傳學(xué)研究，對推動金花茶資源的有效保護及高效利用具有重要意義。

瀕危植物的保育研究不僅僅要保護其種群數(shù)量，更重要的是保護其遺傳多樣性[4]。對稀有瀕危和受人類干擾破壞的植物，首先應(yīng)查明當前種群遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)，明確其種群間及種群內(nèi)的遺傳變異及遺傳特性[5]。在金花茶遺傳多樣性研究方面，有關(guān)人員已開展了遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)的隨機擴增多態(tài)性(randomly amplified polymorphic DNA，RAPD)、區(qū)間簡單重復(fù)序列(inter-simple sequence repeats，ISSR)和擴增片段長度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism，AFLP)分析[6-9]。目前，對金花茶掠奪式開發(fā)利用使其原有天然資源遭到嚴重破壞，生態(tài)環(huán)境的惡化進一步導(dǎo)致種群退化，分布范圍不斷縮小，種群數(shù)量急劇減少。因此，開展現(xiàn)有金花茶資源的遺傳多樣性與遺傳結(jié)構(gòu)研究，進一步評估生態(tài)環(huán)境及人為干擾因素等對金花茶種群數(shù)量及遺傳多樣性的影響具有重要意義。AFLP標記技術(shù)具有重復(fù)性好、可靠性強和多態(tài)性高等優(yōu)點[10]，在遺傳多樣性研究中被廣泛應(yīng)用[11-12]，可有效應(yīng)用于金花茶遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)研究[7]。鑒于此，筆者應(yīng)用AFLP技術(shù)對我國現(xiàn)有金花茶天然種群的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)進行分析，研究其遺傳變異規(guī)律，為金花茶資源的保護和進一步開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

2015—2017年，對我國金花茶資源進行了全面系統(tǒng)的勘察，通過查閱資料、訪問和實地踏查發(fā)現(xiàn)，目前金花茶天然種群主要存在于廣西防城港市防城區(qū)，且呈現(xiàn)間斷性分布特征，生境片斷化嚴重，個體數(shù)量不足1 000株。根據(jù)金花茶天然種群分布情況，選擇4個種群作為研究對象，其中種群1位于廣西防城港市防城區(qū)大菉鎮(zhèn)，種群2、3和4位于廣西防城港市防城區(qū)華石鎮(zhèn)。采用間隔距離取樣法[13]，在所選擇種群內(nèi)隨機采樣，植株距離在50 m以上，每個種群采樣個體數(shù)量取決于群體規(guī)模，共選擇110株個體(表1)，采集植株枝條中部南面向陽處成熟葉片5個以上，于變色硅膠中干燥保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總DNA提取

葉片加液氮后研磨，用CTAB法[13]提取總DNA。

表1金花茶種群采樣位置

Table1SamplinglocationofCamellianitidissimapopulations

種群編號樣本數(shù)緯度(N)經(jīng)度(E)海拔/m坡度/(°)Pop13821°18′16″108°10′24″173.7215Pop22221°19′08″108°19′36″73.1930Pop32621°19′32″108°19′25″148.5230Pop42421°19′53″108°19′47″257.6545

1.3 AFLP實驗

1.3.1酶切與連接

反應(yīng)體系總體積為20 μL，含4 μL DNA模板(50 ng·μL-1)，1 μL Adapter，2 μLHindⅢ/MseⅠ，2.5 μL 10×Reaction buffer，2.5 μL 10 mmol·L-1ATP，1 μL T4 Ligase，7 μL H2O。37 ℃條件下消化5 h，8 ℃條件下消化4 h。

1.3.2PCR擴增

預(yù)擴增：反應(yīng)體系總體積為25 μL，含2 μL連接后模板DNA，18.5 μL雙蒸水，0.5 μL dNTPs，1 μL Pre-ampmix，2.5 μL 10×PCR buffer，0.5 μLTaqDNA 聚合酶。擴增程序：94 ℃條件下2 min；然后94 ℃條件下30 s，56 ℃條件下30 s，72 ℃條件下80 s，30個循環(huán)；最后72 ℃條件下5 min。預(yù)擴增產(chǎn)物稀釋20倍后作為選擇擴增模板。

選擇擴增：反應(yīng)體系總體積為25 μL，其中含2 μL稀釋后的預(yù)擴增產(chǎn)物，17.5 μL雙蒸水，2.5 μL 10×PCR buffer，1 μLHindⅢ引物，1 μLMseⅠ引物，0.5 μL dNTPs和0.5 μLTaqDNA 聚合酶。擴增程序：94 ℃條件下4 min；94 ℃條件下30 s，65 ℃條件下30 s，72 ℃條件下80 s；然后每循環(huán)1次退火溫度遞減0.7 ℃，12個循環(huán)；94 ℃條件下30 s，55 ℃ 條件下30 s，72 ℃條件下80 s，23個循環(huán)；72 ℃ 條件下5 min。PCR 產(chǎn)物用15 g·L-1瓊脂糖凝膠(0.5 μg·mL-1溴化乙錠)于5 V·cm-1電壓下電泳90 min，用凝膠成像系統(tǒng)(FR-200A)拍照并記錄。

1.4 數(shù)據(jù)分析

擴增產(chǎn)物的電泳結(jié)果采用“1-0”系統(tǒng)記錄譜帶，樣品有帶記為1，無帶或弱帶則記為0。應(yīng)用GenAlEx 6.41軟件計算遺傳多樣性各參數(shù)。

LPP=P/Pt×100%。

(1)

式(1)中，LPP為多態(tài)位點(種群中某個位點具有兩個等位基因時稱該位點為多態(tài)位點)百分率，%；P為多態(tài)位點數(shù)；Pt為總位點數(shù)。

H=1-∑Xi2，

(2)

IS=-∑XilnXi，

(3)

Ne=1/(1-H)。

(4)

式(2)～(4)中，H為基因多樣性指數(shù)；Xi為位點i在種群中出現(xiàn)頻率；IS為Shannon信息指數(shù)；Ne為有效等位基因數(shù)。

觀測等位基因數(shù)(Na)由直接觀測統(tǒng)計得到。

(5)

D=lnI。

(6)

式(5)～(6)中，I為遺傳一致度；Xi、Yi分別為種群X、Y中第i條基因頻率；D為遺傳距離。

Fst=(Ht-Hs)/Ht，

(7)

Nm=(1-Fst)/4Fst。

(8)

式(7)～(8)中，F(xiàn)st為遺傳分化系數(shù)；Ht為種群總基因多樣性指數(shù)；Hs為種群內(nèi)基因多樣性指數(shù)；Nm為基因流。

根據(jù)遺傳距離(D)矩陣，采用NTSYSpc 2.0軟件，按非加權(quán)組平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA)進行聚類分析，構(gòu)建聚類圖[10-12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 AFLP擴增位點多態(tài)性

從48對引物中篩選出擴增產(chǎn)物穩(wěn)定、重復(fù)性好、多態(tài)性高且分辨能力強的引物8對，對4個金花茶種群110個個體進行擴增，擴增結(jié)果見表2。由表2可知，8對引物共擴增出1 619個DNA位點，其中1 473個具多態(tài)性，多態(tài)性位點百分率為90.98%。8對引物擴增出的DNA位點主要位于70～500 bp之間，DNA位點數(shù)介于187～214之間，平均為202.38。引物A-1擴增出的DNA位點數(shù)最多，為214；引物C-8擴增出的位點數(shù)最少，為187；引物A-1多態(tài)性位點百分率最高，為96.26%；引物H-4多態(tài)性位點百分率最低，為82.32%。部分樣品利用引物B-1和H-4的擴增結(jié)果見圖1，可見，引物擴增出的DNA位點數(shù)及多態(tài)性均較高。

表2金花茶AFLP擴增引物

Table2PrimersusedforAFLPamplificationofCamellianitidissima

引物編號引物堿基擴增位點數(shù)量多態(tài)性位點數(shù)量多態(tài)性位點百分率/%A-1AAC/ CAA21420696.26B-1AAG/ CAA21120295.73C-8ACA/ CTT18716588.24D-3ACT/ CAG19717488.32E-1ACC/ CAA20919794.26H-4AGG/ CAT19816382.32H-6AGG/ CTC20518791.22H-7AGG/ CTG19817990.40總數(shù)1 6191 473平均值202.38184.1390.98

圖1 引物B-1和H-4的AFLP擴增結(jié)果

2.2 金花茶種群遺傳多樣性

金花茶種群遺傳多樣性的AFLP分析結(jié)果見表3，金花茶4個天然種群的多態(tài)位點百分率以種群3為最低，以種群1為最高。不同種群的基因多樣性指數(shù)和Shannon信息指數(shù)分析結(jié)果一致，均以種群2為最高，以種群3為最低。金花茶物種水平基因多樣性指數(shù)和Shannon信息指數(shù)均略高于種群水平,金花茶物種水平多態(tài)位點百分率遠高于種群水平。

表3金花茶種群遺傳多樣性

Table3GeneticdiversityofCamellianitidissimapopulations

種群多態(tài)位點百分率/%觀測等位基因數(shù)有效等位基因數(shù)基因多樣性指數(shù)Shannon信息指數(shù)Pop172.111.4521.2110.1360.223Pop270.141.4101.2130.1380.228Pop356.831.1461.1930.1220.197Pop464.871.3041.2000.1290.212種群水平65.991.3281.2050.1310.215物種水平93.631.8731.2190.1460.246

2.3 金花茶種群遺傳結(jié)構(gòu)

表4顯示，種群間遺傳分化系數(shù)介于0.139～0.289之間，遺傳變異主要存在于種群內(nèi)；種群間遺傳分化系數(shù)最小為Pop1和Pop2間，最大為Pop1和Pop3間。種群間的基因流在0.616～1.548之間，最小為Pop1和Pop3間，最大為Pop1和Pop2間。種群遺傳變異的分子變異分析(AMOVA)表明，金花茶天然種群間遺傳變異為18.48%，種群內(nèi)遺傳變異為81.52%(表5)。AMOVA分析結(jié)果與金花茶種群遺傳分化系數(shù)結(jié)果基本一致，說明金花茶種群間和種群內(nèi)均發(fā)生遺傳變異，且種群內(nèi)變異為主要遺傳變異。

表4金花茶種群間遺傳分化系數(shù)和基因流

Table4GeneticdifferentiationcoefficientandgeneflowofCamellianitidissimapopulations

種群Pop1Pop2Pop3Pop4Pop10.0001.5480.6161.088Pop20.1390.0000.6901.002Pop30.2890.2660.0000.874Pop40.1870.2000.2220.000

對角線左下方為遺傳分化系數(shù)，對角線右上方為基因流。

表5金花茶種群間和種群內(nèi)分子變異的方差分析

Table5Analysisofmolecularvariance(AMOVA)amongandwithinCamellianitidissimapopulations

變異來源自由度(df)平方和(SS)均方(MS)方差分量方差分量百分率/%種群間 31 882.161941.08033.18718.48種群內(nèi)10615 522.179146.436146.43681.52總計10918 517.6641 113.324179.623100.00

2.4 金花茶種群遺傳關(guān)系的UPGMA聚類分析

表6顯示，各種群遺傳一致度介于0.969～0.984之間，遺傳一致度較大，相似性較高，其中Pop1和Pop2種群遺傳一致度最高，Pop1和Pop3最低；各種群遺傳距離介于0.016～0.032之間，遺傳距離較小。根據(jù)種群遺傳距離，對4個金花茶種群進行UPGMA聚類分析，建立遺傳關(guān)系的UPGMA聚類圖(圖2)。由圖2可知，4個金花茶種群既具有相似遺傳背景，又存在一定差異，Pop1和Pop2首先聚類，然后與Pop4聚為一類，Pop3單獨聚類。4個金花茶種群未完全按照地理距離進行聚類，說明種群間遺傳變異與其地理距離無明顯相關(guān)性。

表6金花茶種群遺傳一致度和遺傳距離

Table6GeneticidentityandgeneticdistanceofCamellianitidissimapopulations

種群Pop1Pop2Pop3Pop4Pop10.0000.0160.0320.022Pop20.9840.0000.0290.023Pop30.9690.9710.0000.023Pop40.9790.9780.9770.000

對角線左下方為遺傳一致度，對角線右上方為遺傳距離。

圖2 金花茶種群遺傳距離聚類

3 討論

RAPD標記通用性強，操作方便，可用于種質(zhì)資源鑒定及分類研究等，但其可重復(fù)性較差，可靠性較低[14]；限制性片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)標記穩(wěn)定性強，適用于分析群體遺傳變異及親緣關(guān)系，但操作復(fù)雜，成本較高，不適于大量樣品檢測[14]；ISSR標記檢測便捷，通用性強，在資源鑒定、遺傳多樣性及系統(tǒng)發(fā)育等研究方面被廣泛應(yīng)用[15]。筆者采用的AFLP技術(shù)在缺乏分子遺傳學(xué)背景的植物遺傳多樣性評價中具有優(yōu)勢，其與RAPD、RFLP和ISSR等均為顯性標記，在數(shù)據(jù)分析上具有一定可比性。4個金花茶天然種群110個個體的AFLP分析結(jié)果表明，8對引物共擴增出1 619個DNA位點(平均每條引物202.38個位點)，1 473個具有多態(tài)性，平均多態(tài)位點百分率為90.98%，能有效檢測金花茶天然種群遺傳多樣性。

NYBOM[16]對用不同標記技術(shù)研究植物遺傳多樣性的結(jié)果進行了統(tǒng)計分析，結(jié)果表明，多年生植物的遺傳多樣性平均為0.25，區(qū)域分布種為0.21。對山茶屬廣布種山茶(Camelliajaponica)的研究表明，我國8個山茶種群和中日13個山茶種群物種水平基因多樣性指數(shù)分別為0.256 9和0.341 4，高于多年生植物種群平均遺傳多樣性[17]。毛瓣金花茶(Camelliapubipetala)6個天然種群物種水平基因多樣性指數(shù)為0.245 1，其遺傳多樣性亦較高[18]。山茶屬瀕危植物杜鵑紅山茶(Camelliaazalea)僅分布于我國廣東鵝凰嶂自然保護區(qū)，分布范圍小于100 km2，僅有1 000余株[19]，種群遺傳多樣性的RAPD和ISSR分析結(jié)果表明，杜鵑紅山茶基因多樣性指數(shù)分別為0.143 5和0.219 1[20-21]，種群遺傳多樣性較低。

賓曉蕓等[6]利用ISSR技術(shù)對4個金花茶天然種群126個個體的研究表明，物種基因多樣性指數(shù)為0.230 2，Shannon信息指數(shù)為0.350 2。TANG等[7]利用RAPD和AFLP技術(shù)對6個金花茶天然種群120個個體的研究表明，其物種基因多樣性指數(shù)為0.269 8和0.244 4，Shannon信息指數(shù)為0.404 3和0.368 2。WEI等[8]利用ISSR技術(shù)對12個金花茶天然種群的研究發(fā)現(xiàn)，金花茶基因多樣性指數(shù)為0.156 1，Shannon信息指數(shù)為0.249 0，且種群規(guī)模的大小與其遺傳多樣性之間無明顯相關(guān)性。筆者對4個金花茶天然種群110個個體的AFLP分析表明，其物種水平基因多樣性指數(shù)和Shannon信息指數(shù)分別為0.146和0.246，遠低于已有金花茶天然種群的ISSR[6]、RAPD和AFLP分析結(jié)果[7]，亦低于WEI等[8]ISSR研究結(jié)果。可見，隨著時間推移，金花茶天然種群的遺傳多樣性大大降低。

山茶遺傳結(jié)構(gòu)研究表明，遺傳變異主要存在于種群內(nèi)個體間，地理距離與遺傳距離具顯著相關(guān)性，島嶼地理隔離對山茶種群的遺傳分化具有重要影響[17]。羅曉瑩等[20]對3種瀕危植物的研究表明遺傳變異主要存在于種群內(nèi)，瀕危植物杜鵑紅山茶的亞種群間遺傳分化較小[21]。毛瓣金花茶的遺傳變異主要在種群內(nèi)個體間，種群間的遺傳變異較低，種群遺傳距離和地理距離之間存在顯著相關(guān)性[18]。WEI等[8]采用ISSR技術(shù)的研究表明，金花茶種群間遺傳變異為41.85%，種群內(nèi)變異為主要遺傳變異，TANG等[7]研究亦表明金花茶遺傳變異主要存在于種群內(nèi)。筆者研究中種群遺傳變異的AMOVA分析表明，金花茶種群間遺傳變異為18.48%，種群內(nèi)遺傳變異為81.52%，種群內(nèi)變異為主要遺傳變異；金花茶種群聚類結(jié)果與地理距離不完全相符，種群間遺傳變異與其地理距離無明顯相關(guān)性[18]。

關(guān)于金花茶天然種群遺傳多樣性較低、種群間遺傳變異較小等特點，筆者認為主要是兩個方面原因共同作用的結(jié)果。一是金花茶天然種群雖然曾廣泛分布于廣西南寧的扈寧區(qū)、隆安縣和扶綏縣及防城港市防城區(qū)、東興市等[2,9]，但隨著金花茶開發(fā)利用熱潮的興起，強烈的利益驅(qū)動使金花茶天然資源幾乎被挖掘破壞殆盡。此外，對金花茶花朵的大量需求導(dǎo)致金花茶種子難以形成，進而導(dǎo)致種群幼苗無法獲得有效補充。二是隨著經(jīng)濟社會發(fā)展，大量植被被破壞，金花茶生境嚴重片斷化、破碎化，種群內(nèi)近交頻率、遺傳漂變增加，等位基因流失，導(dǎo)致種群的遺傳多樣性和遺傳變異不斷降低?？梢?，人為干擾破壞及生態(tài)環(huán)境的惡化導(dǎo)致金花茶天然種群嚴重退化，分布范圍不斷縮小，種群數(shù)量急劇減少，與前期相關(guān)研究[6-9]相比，金花茶天然種群的遺傳多樣性及遺傳變異降低，種群間遺傳變異與其地理距離無明顯相關(guān)性。

韋霄等[9]采集了金花茶主要分布區(qū)內(nèi)種子，利用種子培育出的實生樹建立了金花茶種質(zhì)圃，采用ISSR標記對金花茶種質(zhì)圃內(nèi)3個種群進行遺傳多樣性分析，與天然種群遺傳參數(shù)比較，認為遷地保護基本上保護了金花茶的遺傳多樣性，具有一定可行性。鑒于金花茶種群遺傳變異主要存在于種群內(nèi)個體間，建議對金花茶現(xiàn)有種群實施就地保護，建立金花茶種群保護區(qū)，嚴禁人為采挖、摘花等干擾活動，同時對其生長環(huán)境進行嚴格保護，保持其生存的生態(tài)系統(tǒng)，促進種群自然更新。在就地保護的基礎(chǔ)上實施遷地保護，通過采種育苗、扦插繁殖等方式進行人工繁殖，建立種質(zhì)資源圃進行遷地保護，對人工栽培群體進行仿生栽培、回歸自然馴化及回遷等，從而逐漸恢復(fù)并保護金花茶種群數(shù)量及遺傳多樣性。

4 結(jié)論

目前，金花茶物種水平基因多樣性指數(shù)和Shannon信息指數(shù)為0.146和0.246，種群水平基因多樣性指數(shù)和Shannon信息指數(shù)為0.131和0.215，遠低于已有金花茶天然種群的研究結(jié)果；4個金花茶天然種群的多態(tài)位點百分率、基因多樣性指數(shù)和Shannon信息指數(shù)變化趨勢一致。金花茶種群內(nèi)遺傳變異為81.52%，種群間遺傳變異為18.48%，遺傳變異主要存在于種群內(nèi)個體間；種群間遺傳變異與其地理距離無明顯相關(guān)性。金花茶天然種群遭受了嚴重的干擾破壞，種群嚴重退化，分布范圍持續(xù)縮小，種群數(shù)量大幅度減少，遺傳多樣性大大降低。根據(jù)金花茶遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)特點，應(yīng)建立金花茶天然種群保護區(qū)，對種群實施就地保護，同時保護其生境條件及生態(tài)系統(tǒng)，促進其種群自然更新；應(yīng)建立金花茶種質(zhì)資源圃，進行遷地保護。