曾研章

廣東省陽江市婦幼保健院，廣東陽江 529500

產前診斷在預防出生缺陷胎兒中是一條主要的途徑，羊膜腔穿刺羊水細胞染色體核型分析是用于產前診斷染色體異常的“金標準”，對于非整倍體的檢出率較高，對于10Mb及以上的缺失或重復、胎兒染色體數目異常和結構異常均可作出全面的分析[1]。染色體微陣列分析（CMA）對于出生缺陷、出生畸形與智力低下都有顯著的評估價值[2]?；诖?，本研究選擇2018年4月～2019年3月我院行產前診斷的126例孕婦為研究對象，所有孕婦均接受羊水細胞染色體核型分析，同時接受CMA分析，進一步探討羊水細胞染色體核型分析結合CMA用于產前診斷的價值，現報道如下。

表1 非整倍體異常檢測結果

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年4月～2019年3月我院行產前診斷的126例孕婦為研究對象，所有孕婦均自愿接受羊水細胞染色體核型分析和CMA檢測，均至少滿足以下一個產前診斷指征[3]：（1）35歲及以上高齡孕婦；（2）超聲異常，如羊水過多、羊水過少、胎兒超聲軟標記（胎兒頸項透明層增厚NT≥3mm、雙側脈絡叢囊腫、側腦室輕度增寬等）、胎兒發(fā)育異常、可疑畸形、嚴重先天性心臟病、胎兒水腫等；（3）不良妊娠史或夫妻中的一方有家族遺傳病史；（4）孕早期不良接觸史；（5）產前母血清經篩查判定為高風險，或經無創(chuàng)性產前檢測（NIPT）判定為高風險或臨界風險；（6）經無創(chuàng)產前基因檢測顯示異常，如提示可疑染色體微缺失或重復，可疑21、18和13以外的其他染色體異常者。孕婦年齡22～45歲，平均（32.4±3.3）歲，孕周12～35周，平均（22.4±5.2）周，本研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準，所有孕婦及家屬均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 試劑和儀器 染色體核型分析：培養(yǎng)基、秋水仙素、KCL溶液、植物血細胞凝集素、胰蛋白酶液、甲醇、冰乙酸、NaOH溶液、細胞培養(yǎng)箱、生理鹽水均由南京道斯夫生物科技有限公司提供、全自動染色體分析儀（美國貝克曼庫爾特）、Giemsa染色液（上海素爾生物科技有限公司），CMA檢測（Affymetrix公司）：DNA提取試劑盒、微陣列芯片、OMIM、ISCA、DGV、UCSC等數據庫查詢數據。

1.2.2 方法 （1）羊水細胞染色體核型分析：常規(guī)消毒后在超聲引導下進行羊膜腔穿刺術抽取25mL羊水，分別置入3支無菌離心管，經1400r/min離心10min，去除上清液并加入羊水培養(yǎng)基制備細胞懸液，按照三線接種在培養(yǎng)瓶中，放入5%二氧化碳培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)，7 ～ 8d換液，培養(yǎng)10d左右根據細胞的生長情況收獲，常規(guī)制片，CTG-胰酶顯帶，在顯微鏡下進行染色體核型分析，30個分裂相計數，分析5個核型，存在異常核型時增加計數量。（2）CMA檢測：羊水10mL送檢，微陣列芯片為Affymetrix公司提供，按照Affymetrix公司流程進行檢測，微陣列芯片包含200 000 SNP標記與550 000 CNV標記，1個標記平均4kb密度分布在人類整個基因組（非全染色體基因組所有位點），對全基因組中有臨床意義的染色體微缺失、微重復、染色體拷貝數變化、雜合性缺失進行檢測。通過在線公共數據庫、醫(yī)院數據庫進行數據分析。

2 結果

2.1 胎兒染色體非整倍體異常

CMA檢測顯示胎兒染色體非整倍體異常與羊水細胞染色體核型分析結果一致，無差異，見表1；且所有染色體非整倍體異常均檢測出，并且對于核型分析無法確定異常片段來源與性質的，CMA檢測顯示了DNA水平的精細結果，其中47，XN，+mar病例無法確定的標記染色體，經CMA檢測確定為22號染色體22q11.1q11.21區(qū)段有1.7Mb片段的2次重復，顯示胎兒為額外idic（22）（q11.2）標記染色體攜帶者。同時，CMA檢測還能夠檢測出額外的、具有臨床意義的基因拷貝數，如21-三體綜合征的1例胎兒1號染色體1q21.1q21.2區(qū)段存在1.8Mb片段重復，含OMIM基因13個。但CMA檢測無法發(fā)現胎兒染色體結構異常，如21-三體綜合征的1例胎兒，染色體核型為47，XN，+21，der（21：21）（q10：q10）。

2.2 胎兒染色體不平衡變異

經羊水細胞染色體核型分析顯示3例胎兒染色體不平衡易位，對胎兒父母外周血染色體核型進行分析顯示，其中2例為平衡易位攜帶者，另1例經高分辨率染色體核型分析顯示父親18號染色體臂間倒位。染色體不平衡變異均來源于遺傳。經CMA檢出染色體不平衡變異與染色體核型分析結果相同，并且更加精確的作出異常定位，顯示亞顯微水平的微缺失與微重復。見表2。

2.3 胎兒染色體嵌合體異常

經染色體核型分析顯示，2例胎兒染色體嵌合體異常，其中1例顯示為低水平嵌合，CMA檢測無法完全檢出，另1例染色體核型分析結果與CMA檢測一致，并且CMA檢測顯示出更為精確的異常位點，見表3。

2.4 羊水細胞染色體核型分析正常但CMA異常的結果

經羊水細胞染色體核型分析顯示有3例正常胎兒經CMA檢測為異常，檢出拷貝數變異片段大小為496.8kb、827.2kb、16.7Mb，見表4。經多個數據庫的分析顯示，片段內涉及的OMIM基因均與胎兒表型疾病相關，因此本次受檢孕婦中3例羊水細胞染色體核型分析正常但CMA異常的胎兒拷貝數具有致病性，CMA技術檢出率比羊水細胞染色體核型分析提高2.38%（3/126）。

表2 胎兒染色體不平衡變異檢測結果

表3 胎兒染色體嵌合體異常檢測結果

表4 羊水細胞染色體核型分析正常但CMA異常的結果

3 討論

產前診斷的對象主要為35歲以上的高齡產婦，以及母血清學篩查高風險、產前超聲異常的孕婦等[4]，染色體核型分析技術與細胞培養(yǎng)均是傳統的產前診斷方式，但羊膜腔穿刺是一種有創(chuàng)操作，孕婦的接受度較差，因此產前診斷醫(yī)師對于羊膜腔穿刺指征的明確非常重要[5]。染色體微陣列分析（CMA）也被稱為染色體分子核型分析或基因芯片技術，包括有單核苷酸多態(tài)微陣列（SNP array）和比較基因組雜交微陣列（array CGH）[6]，可對全基因組進行精確、高分辨率的染色體微缺失與微重復的檢測，與羊水細胞染色體核型分析相比，其優(yōu)勢在于高分辨率、高通量、高自動化檢測，并且能夠對許多和先天性疾病與出生缺陷相關的基因組異常進行一次同步檢測[7]。

本研究以126例孕婦為研究對象，探討羊水細胞染色體核型分析結合CMA用于產前診斷的價值。結果顯示：（1）CMA技術用于產前診斷的有效性和準確性更高，對于染色體核型正常的CMA檢測可發(fā)現有基因拷貝數變異。經羊水細胞染色體核型分析共檢測出胎兒染色體非整倍體異常12例，CMA檢測結果與之相同盡管CMA檢測無法發(fā)現胎兒染色體結構異常，但21三體綜合征的檢測是準確有效的，對于核型分析無法確定來源與性質的異常片段，CMA能夠進行DNA水平的精細分析而獲得更為準確的結果，如22號染色體為額外idic（22）（q11.2）標記染色體攜帶者，涉及貓眼綜合征關鍵區(qū)域[8]，結果提示，CMA技術對于染色體核型分析可檢測到的變異，可精確地鑒定核型中未知額外的染色體內容和來源，對于遺傳咨詢臨床解決決定具有指導意義[9-10]。（2）CMA檢出染色體不平衡變異與染色體核型分析結果相同，CMA技術可以更加準確地反映變異區(qū)帶、變異類型、基因數目，顯示亞顯微水平的微缺失和微重復，信息更加全面[11]。（3）經染色體核型分析共檢測出胎兒染色體嵌合體異常2例，1例由于低水平嵌合，CMA檢測無法完全檢出，但對于高比例的嵌合體，CMA檢測顯示出更為精確的異常位點，Xp22.33q11.1區(qū)段61.7Mb片段缺失。結果提示，CMA對未培養(yǎng)的細胞檢測具有優(yōu)勢，培養(yǎng)后的嵌合情況由于正常細胞生長比異常細胞更具有優(yōu)勢而降低，因此不容易檢出[12]，在嵌合體檢出核型分析中還需要結合基因芯片。（4）羊水細胞染色體核型分析正常但CMA異常：由于CMA技術一次可同時對幾十萬甚至上百萬的DNA片段進行檢測，無論這些片段有無臨床意義，與個體變異有無關系均可檢測[13]，結合數據庫的應用明確基因拷貝數內包含疾病的相關突變，以及基因致病突變的性質[14]。本次結果中經羊水細胞染色體核型分析顯示有3例正常胎兒經CMA檢測為異常，檢出拷貝數變異片段大小為496.8kb、827.2kb、16.7Mb，通過基因型-表型分析，判斷為致病拷貝數，1例全前腦。唇腭裂臨床表型包括眼部異常、小腦發(fā)育不良；1例15號染色體增多臨床表型為智力障礙、腦發(fā)育異常；1例NT增厚缺失片段與智力障礙與身材矮小有關[15]。

綜上所述，CMA技術在孕婦產前診斷中的有效性和準確性更高，臨床上可以結合兩種檢測方式提高胎兒出生缺陷的檢出率。