陳海倫 羅幸波 宏小翠 楊海霞 易智君

1.廣東省惠州市中心人民醫(yī)院 中山大學附屬惠州醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東惠州 516001；2.廣東醫(yī)科大學附屬醫(yī)院腫瘤中心，廣東湛江 524001；3.廣東省惠州市中心人民醫(yī)院 中山大學附屬惠州醫(yī)院病理科，廣東惠州 516001

卵巢癌為目前高發(fā)的女性生殖道三大常見惡性腫瘤之一，和其他類型的惡性腫瘤一樣，卵巢癌發(fā)生、發(fā)展是極其復(fù)雜的過程，涉及多基因、多步驟、多階段等因素[1-5]；程序性細胞死亡因子4（PDCD4，Programmed cell death 4）是一種近期發(fā)現(xiàn)的新型腫瘤抑制基因并且與細胞凋亡相關(guān)，與多種腫瘤的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移發(fā)展關(guān)系密切[6-8]；Clusterin是新近發(fā)現(xiàn)的一種凋亡相關(guān)因子，具有細胞保護功能的作用，廣泛存在于人類和動物的多種組織中，其異常表達與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)[9-11]；本研究采用免疫組化法檢測PDCD4及Clusterin在卵巢上皮性癌組織中的表達情況，探討PDCD4和Clusterin與卵巢上皮性癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2015年1月～2019年1月惠州市中心人民醫(yī)院（中山大學附屬惠州醫(yī)院、廣東醫(yī)科大學惠州臨床醫(yī)學院）以及廣東醫(yī)科大學附屬醫(yī)院門診活檢或者住院手術(shù)病理標本共95例，均為女性患者標本；其中35例卵巢良性腫瘤組織（子宮內(nèi)膜樣腺瘤7例、漿液性囊腺瘤17例、透明細胞瘤1例、黏液性囊腺瘤10例），患者年齡19～86歲、中位發(fā)病年齡50歲，60例卵巢上皮性癌組織（子宮內(nèi)膜樣腺癌8例、漿液性囊腺癌40例、透明細胞癌2例、黏液性囊腺癌10例），患者年齡20～85歲、中位發(fā)病年齡49歲；納入標準：病理結(jié)果證實為原發(fā)性卵巢良性腫瘤組織或卵巢上皮性癌，知情同意；排除標準：病理結(jié)果證實為原發(fā)于其他部位轉(zhuǎn)移至卵巢的上皮性癌，未簽署知情同意。卵巢上皮性癌采用FIGO分期標準施行相應(yīng)具體分期，其中Ⅰ期卵巢上皮性癌為17例，Ⅱ期卵巢上皮性癌為14例，Ⅲ期卵巢上皮性癌為17例，Ⅳ期卵巢上皮性癌為12例；低分化卵巢上皮性癌為24例、中分化卵巢上皮性癌為23例，高分化卵巢上皮性癌為13例；所有卵巢癌病例術(shù)前均未行靶向治療、免疫治療、化學藥物治療以及放射治療，各組間一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；兔抗人PDCD4多克隆抗體和兔抗人Clusterin多克隆抗體購自santa cruz公司，即用型免疫組化試劑盒購自中國北京中杉金橋公司。

1.2 免疫組化檢測方法

將厚度為4μm的石蠟包埋組織切片，常規(guī)脫蠟至水化程度，切片浸泡于50mmol/L乙二胺四乙酸溶液（pH8.0）中，微波抗原修復(fù)10min，冷卻至室溫，之后充分水沖洗，然后用PBS浸泡洗，滴入正常山羊血清封閉液中，室溫保存20min；丟棄多余的液體，不予任何洗滌，加入PDCD4多克隆抗體或者Clusterin多克隆抗體4℃過夜，PBS洗滌；在37℃條件下，滴加予SP 9000通用生物素標記二抗40min；給二氨基聯(lián)苯氨30s顯色，予以蘇木精重新染色，乙醇脫水、透明，中性樹膠封固。制備二氨基聯(lián)苯胺顯色液的規(guī)定步驟：將DAB 5mg溶于100mL 0.05mol/L的Tris-鹽酸（pH7.6）中，加入10μL 30%過氧化氫，攪拌均勻后過濾（使用前予新配制）；以上述公司提供的常規(guī)陽性切片作為陽性對照品，PBS代替一抗作為陰性對照品。

1.3 陽性結(jié)果判定

PDCD4以及Clusterin以細胞質(zhì)或者細胞核內(nèi)出現(xiàn)有棕黃或者棕色顆粒為陽性細胞。采用半定量積分法測定表達結(jié)果，染色強度以及陽性細胞的比例分別登注為0～3分。染色強度：未著色0分，淺著色1分，中度著色2分，深著色3分。陽性細胞的百分率：在高倍鏡下隨機選擇10個清晰視野（×400），每個視野計數(shù)100個細胞，計算平均陽性百分率。根據(jù)平均陽性細胞百分率分為：陽性細胞數(shù)≤5%登注為0分，6%～25%登注為1分，26%～49%登注為2分，≥50%登注為3分。兩項評分相加，0～1分登注為（-），2分登注為（+），3～4分登注為（++），5～6分登注為（+++），（+）～（+++）均示為陽性[12]。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS20.0軟件對相關(guān)數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料以[n（%）]表示，采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 PDCD4和Clusterin在卵巢上皮性癌組織以及卵巢良性腫瘤組織中的表達情況

PDCD4在卵巢上皮性癌組織中的陽性表達率為40.00%（24/60），明顯低于卵巢良性腫瘤組織中的陽性表達率82.86%（29/35），兩者比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；Clusterin在卵巢上皮性癌組織中的陽性表達率為71.67%（43/60），明顯高于卵巢良性腫瘤組織中的陽性表達率14.29%（5/35），兩者比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 PDCD4和Clusterin在卵巢上皮性癌組織和卵巢良性腫瘤組織的表達情況[n（%）]

表2 PDCD4表達水平與卵巢上皮性癌臨床病理特征之間的關(guān)系

表3 Clusterin表達水平與卵巢上皮性癌臨床病理特征之間的關(guān)系

2.2 PDCD4在卵巢上皮性癌組織中的表達與臨床病理特征之間的關(guān)系

結(jié)果表明PDCD4表達水平與卵巢上皮性癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、FIGO分期以及組織學分化程度明顯相關(guān)（P＜0.05）。見表2。

2.3 Clusterin在卵巢上皮性癌組織中的表達與臨床病理特征之間的關(guān)系

結(jié)果表明Clusterin表達水平與卵巢上皮性癌組織學分化程度、以及FIGO分期明顯相關(guān)（P＜0.05）。見表3。

3 討論

PDCD4是一種新的腫瘤抑制mRNA，PDCD4表達的調(diào)節(jié)機制十分復(fù)雜，研究表明PDCD4在細胞凋亡過程中的表達上調(diào)，PDCD4的表達受微小RNA、轉(zhuǎn)化生長因子-β等多種因素的調(diào)控，PDCD4表達水平可以影響轉(zhuǎn)錄、翻譯以及調(diào)節(jié)多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，可在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上調(diào)節(jié)多個下游基因的表達，而且充當腫瘤抑制劑的角色[13]；甘梅富等[14]學者研究表明：結(jié)直腸癌組織中的PDCD4表達水平明顯低于癌旁組織，且在癌組織中PDCD4表達水平與結(jié)直腸癌組織學分級、TNM分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)；本研究結(jié)果表明PDCD4在卵巢良性腫瘤組織以及卵巢上皮性癌組織中表達陽性率依次降低，差異有統(tǒng)計學意義，隨卵巢上皮性癌的FIGO分期增高，卵巢上皮性癌組織中PDCD4表達陽性率亦降低；卵巢上皮性癌組織低分化者的PDCD4表達陽性率明顯低于卵巢上皮性癌組織高分化者的PDCD4表達陽性率和卵巢上皮性癌組織中分化者的PDCD4表達陽性率；卵巢上皮性癌有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的PDCD4表達陽性率明顯低于卵巢上皮性癌無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的PDCD4表達陽性率；提示PDCD4在卵巢上皮性癌組織中的表達水平與PDCD4淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學分化程度以及FIGO分期明顯相關(guān)；作為腫瘤抑癌基因的PDCD4在卵巢上皮性癌的發(fā)生、發(fā)展中起著一定的作用。

Clusterin亦稱為TRPM2（ testosterone repressed message 2）、SGP2 （sulfated glycoprotein）、是 一 種普遍存在于人體組織細胞中的異源二聚體硫酸化糖蛋白，其功能主要有介導(dǎo)細胞聚集、穩(wěn)定細胞膜、參與脂質(zhì)交換和轉(zhuǎn)運、輔助生殖、抑制補體介導(dǎo)的細胞免疫等，近期研究發(fā)現(xiàn)Clusterin在調(diào)節(jié)細胞周期、細胞凋亡、DNA損傷、細胞粘附、組織重塑中起重要作用[15]；Almaghrabi等[16]學者研究發(fā)現(xiàn)Clusterin在子宮內(nèi)膜樣腺癌組織中總陽性率高于正常組織中的陽性率，Clusterin的陽性率與分化程度相關(guān)，分化程度越高陽性率越高，不同的臨床分期中Clusterin的陽性率亦不相同；本研究結(jié)果表明隨著在卵巢良性腫瘤組織、卵巢上皮性癌組織中Clusterin的表達陽性率依次升高，差異有統(tǒng)計學意義，隨卵巢上皮性癌FIGO分期增高，卵巢上皮性癌組織中Clusterin表達陽性率亦升高；卵巢上皮性癌組織低分化者Clusterin表達陽性率明顯高于高分化者和中分化者；提示Clusterin在卵巢上皮性癌組織中的表達水平與Clusterin組織學分化程度和FIGO分期明顯相關(guān)；上述結(jié)果表明卵巢上皮性癌組織中PDCD4呈低表達和Clusterin呈高表達，檢測PDCD4及Clusterin的表達情況對判斷卵巢上皮性癌的生物學行為有一定的臨床價值。