朱群燕，蔣煊，鄭雅文，黃志偉，徐福遠(yuǎn)，耿武軍，傅紅興，趙應(yīng)征

（1.溫州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 溫州 325035；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 麻醉科，浙江 溫州325035）

胰島移植是目前臨床糖尿病治療領(lǐng)域中一種具有較大潛力的治療手段，盡管埃德蒙頓方案公布后，胰島移植取得了可觀的進(jìn)展，但胰島需要量大、移植后微血管重建慢、胰島功能低下等問(wèn)題仍然阻礙著胰島移植的大規(guī)模應(yīng)用[1-4]。堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fi broblast growth factor，bFGF）具有刺激血管新生、創(chuàng)傷愈合和組織再生等功能[5]。本實(shí)驗(yàn)室前期已證明bFGF能夠促進(jìn)胰島內(nèi)部微血管重建，提高胰島體內(nèi)活性和功能[6]，但bFGF在體內(nèi)半衰期短，單純bFGF培養(yǎng)液與胰島共移植的效果不理想。

重組人膠原蛋白（recombinant human collagen，RHC）是利用基因工程改性所得的一種III型膠原，該膠原能增強(qiáng)血管強(qiáng)度，為細(xì)胞提供養(yǎng)分，從而促進(jìn)新血管的形成[7-8]。為提高胰島移植后療效、減少胰島用量，本研究基于實(shí)驗(yàn)室前期基礎(chǔ)，選用bFGF結(jié)合不同濃度RHC與胰島共移植至同系糖尿病小鼠腎被膜下，并對(duì)術(shù)后胰島功能和組織學(xué)進(jìn)行評(píng)價(jià)，為進(jìn)一步研究降低胰島移植用量和提高移植效果奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：雄性Balb/C小鼠40只，6～8周齡，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和器材：異氟烷（Baxter公司，美國(guó)）；鏈脲佐菌素（STZ）、膠原酶V（sigma，USA）；Ficoll-1077、Ficoll-1119、CMRL-1066、Hanks液（溫州市怡康細(xì)胞移植技術(shù)開發(fā)有限公司）；胎牛血清（Gibco，Thermo Fisher Scientific）；重組人膠原蛋白（江蘇江山聚源生物技術(shù)有限公司）；堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（浙江格魯特生物科技有限公司）；血糖儀（博士醫(yī)生，北京）；恒溫水槽（DKZ-450B，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；離心機(jī)（L500，上海利鑫堅(jiān)離心機(jī)有限公司）；體式顯微鏡（SDT-TL2，上海光泉科儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病模型的建立：Balb/C小鼠造模前禁食12 h，不禁水，測(cè)定空腹血糖值和體重，腹腔注射STZ（55 mg/kg）。造模后第1、3、7天測(cè)定血糖值，血糖值≥22.2 mmol/L 視為糖尿病造模成功，可用于移植實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 小鼠胰島的分離：參考前期的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)[6，9-10]，簡(jiǎn)述如下：取Balb/C小鼠吸入過(guò)量異氟烷致死后，膽總管逆行灌注膠原酶V溶液2.5 mL（濃度為1 mg/mL），摘取胰腺至50 mL離心管中，（37±0.5）℃恒溫水消化至乳糜狀，冷Hanks液終止消化，并用Ficoll-1077和Ficoll-1119進(jìn)行非連續(xù)密度梯度純化，在體視顯微鏡下進(jìn)一步手工挑選。胰島用CMRL-1066培養(yǎng)基（含10% FBS和1%青霉素-鏈霉素）于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后進(jìn)行移植。

1.2.3 胰島鑒定、活性測(cè)定和當(dāng)量計(jì)算：采用常規(guī)的DTZ染色方法鑒定胰島，并用FD/PI染色液染色測(cè)定胰島活性[6]。參照Lembert等[11]方法，在倒置顯微鏡下記錄每個(gè)胰島的直徑，按照胰島當(dāng)量表?yè)Q算成相應(yīng)直徑150 μm的胰島當(dāng)量。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)分組及體外培養(yǎng)：將造模成功的小鼠隨機(jī)分成三組，分別為：（1）Free組（單純胰島移植組）；（2）1 mg/mL RHC+60 ng/mL bFGF組（胰島移植液中含1 mg/mL RHC和60 ng/mL bFGF）；（3）16 mg/mL RHC+60 ng/mL bFGF組（胰島移植液中含16 mg/mL RHC和60 ng/mL bFGF）。胰島基礎(chǔ)移植液與培養(yǎng)液一致，每只小鼠移植胰島當(dāng)量為（200±50）IEQ。以正常Balb/C組（NOR組）、糖尿病小鼠未移植胰島組（DM組）為對(duì)照組。

1.2.5 小鼠腎被膜下移植：參照Z(yǔ)umda等[12]的研究。糖尿病小鼠持續(xù)吸入異氟烷麻醉后，剃去右側(cè)背部毛發(fā)并消毒，暴露腎臟。在體式顯微鏡下用注射器將含（200±50）IEQ胰島的混懸液推注至腎被膜下，棉簽壓迫止血，縫合傷口。皮下注射1 mL生理鹽水補(bǔ)液。每日早晚給予頭孢唑林鈉皮下注射50 μL（濃度50 mg/mL），持續(xù)1周。

1.2.6 移植后胰島功能和療效評(píng)價(jià)

（1）血糖和體重監(jiān)測(cè)：每日觀察小鼠飲食、飲水和精神狀況，測(cè)量和記錄小鼠血糖和體重變化。連續(xù)兩次血糖超過(guò)16.7 mmol/L預(yù)示著小鼠重回高血糖狀態(tài)[13]。

（2）口服糖耐量試驗(yàn)（OGTT）：移植后第30天，將移植組、正常組（NOR組）和糖尿病未移植組（DM組）小鼠禁食過(guò)夜，不禁水。用超純水配制濃度為200 mg/mL的葡萄糖溶液，灌胃劑量為2 mg/g，測(cè)定各組小鼠灌胃前（0 min）和灌胃后20、40、60、90、120 min的血糖值。

（3）移植部位胰島的組織學(xué)評(píng)價(jià)：移植后第30天，取各移植組小鼠，持續(xù)異氟烷吸入麻醉，經(jīng)心臟灌注生理鹽水后，取移植部位腎臟組織并固定于4%多聚甲醛中，進(jìn)行HE、Insulin免疫組化染色和CD31免疫組化染色，觀察移植部位胰島的形態(tài)和新血管生成結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用Graft pad 5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理，所有數(shù)據(jù)用（±s）表示，并采用成對(duì)樣品t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。P＜0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 小鼠胰島的分離和培養(yǎng)結(jié)果

經(jīng)純化和手工挑選后的小鼠胰島純度為（96.4±2.6）%。培養(yǎng)6 h后，胰島外形完整、邊緣清晰，經(jīng)FD/PI染色顯示，平均活性（90.1±3.5）%。

2.2 移植術(shù)后小鼠血糖和體重變化

16 mg/mL RHC+60 ng/mL bFGF組的小鼠胰島移植后血糖下降最快，與1 mg/mL RHC+60 ng/mL bFGF組均能維持正常血糖超過(guò)30 d；Free組胰島移植后血糖未能降至正常水平（見圖1A）。胰島移植治療結(jié)束后，F(xiàn)ree組體重明顯降低[降低（-2.10±2.60）g]，1 mg/mL RHC+60 ng/mL bFGF組[增加（3.36±0.78）g，P＜0.05]和16 mg/mL RHC+60 ng/mL bFGF組[增加（3.04±1.01）g，P＜0.05]小鼠體重則增加明顯（見圖1B）。

圖1 胰島移植后各組小鼠血糖（A）和體重（B）的變化結(jié)果

2.3 口服糖耐量試驗(yàn)（OGTT）

如圖2所示，16 mg/mL RHC+60 ng/mL bFGF組小鼠的糖耐量曲線和NOR組相似，且120 min時(shí)血糖均恢復(fù)到基線水平；Free組和1 mg/mL RHC+60 ng/mL bFGF組小鼠在120 min時(shí)血糖均未能恢復(fù)到基線水平。

圖2 小鼠胰島移植后第30天糖耐量結(jié)果

2.4 移植后腎被膜下胰島的組織學(xué)評(píng)價(jià)

取胰島移植30 d后的小鼠腎組織進(jìn)行HE、insulin素和CD31免疫組化染色，結(jié)果如圖3所示。

由移植部位含胰島組織的HE和insulin免疫熒光染色結(jié)果可見，各移植組腎被膜下的胰島組織形態(tài)完整，且能分泌胰島素（圖3A）。由移植部位胰島組織的CD31染色結(jié)果顯示，1 mg/mL RHC+60 ng/mL bFGF組和16 mg/mL RHC+60 ng/mL bFGF組CD31蛋白表達(dá)較多，說(shuō)明新血管生成較多，而Free組CD31陽(yáng)性表達(dá)較少，說(shuō)明新生血管較少（圖3B）。

3 討論

目前，可供胰島移植用胰腺供體不足和胰島分離純化過(guò)程中造成的胰島內(nèi)部微血管系統(tǒng)的破壞均制約著臨床胰島移植在糖尿病治療中的應(yīng)用[6，14]。為了解決這些問(wèn)題，國(guó)內(nèi)外研究者進(jìn)行了大量的探索，如構(gòu)建三維多孔支架為胰島提供生存的空間[14]、添加生長(zhǎng)因子類藥物促進(jìn)受損微血管重建[6]、應(yīng)用產(chǎn)氧微粒減少胰島中心壞死[15]等。本課題小組初步研究表明，全量胰島移植（400 IEQ）能有效控制糖尿病小鼠的血糖水平。本研究采用胰島聯(lián)合RHC和bFGF共移植，血糖監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示（200±50） IEQ的胰島亦能顯著降低血糖至正常水平，且與單純同當(dāng)量胰島移植的小鼠降低水平的能力有明顯差異（P＜0.01）。本研究亦發(fā)現(xiàn)，RHC-bFGF和胰島共移植組的新生血管數(shù)量明顯增加。

圖3 移植部位腎臟組織HE染色、Insulin免疫熒光染色和CD31免疫組化染色

本研究通過(guò)聯(lián)合應(yīng)用RHC和bFGF，為胰島提供一個(gè)富含bFGF的類細(xì)胞外基質(zhì)的微環(huán)境，能夠促進(jìn)移植后胰島的微血管重建和提高胰島功能、降低維持正常血糖所需的胰島移植量，有助于緩解胰島移植中供體不足的難題。