李怡潔，楊佐忠

(1. 西南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，重慶 400715; 2. 四川省退耕還林還草中心，成都 610081)

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)因其具有綠色無(wú)污染、無(wú)毒無(wú)害、可替代抗生素等眾多優(yōu)異的生物學(xué)特性被廣大學(xué)者及其研究人員研究，同時(shí)也作為一種最早的益生菌類(lèi)群出現(xiàn)在研究人員的視野里?？莶菅挎邨U菌隸屬于芽孢桿菌屬的單細(xì)胞原核生物，無(wú)莢膜，周生鞭毛，可以運(yùn)動(dòng)，一般存在于菌體中央或近似中央位置，芽孢生長(zhǎng)成型后對(duì)菌體體積不產(chǎn)生影響，不會(huì)造成菌體膨大。其分布廣泛、繁殖迅速、并能自生生成抗逆性孢子，成型的菌落多為淡黃色或黃白色，表面多為粗糙不光滑且不透明。枯草芽孢桿菌是中國(guó)農(nóng)業(yè)部門(mén)批準(zhǔn)的應(yīng)用廣泛的益生菌，它是一種可厭氧進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖的革蘭氏陽(yáng)性短桿菌[1]。通過(guò)對(duì)枯草芽孢桿菌的主要作用機(jī)制與應(yīng)用現(xiàn)狀進(jìn)行分析并做出展望，可為后期如何將枯草芽孢桿菌運(yùn)用到生產(chǎn)實(shí)際中提供理論來(lái)源及思路，并為推進(jìn)更加穩(wěn)定、可持續(xù)的生物、農(nóng)業(yè)生態(tài)發(fā)展奠定良好的基礎(chǔ)。

1 枯草芽孢桿菌作用機(jī)制

1.1 維持腸道微生態(tài)平衡

枯草芽孢桿菌以內(nèi)生孢子形態(tài)進(jìn)入動(dòng)物的消化道，在進(jìn)入消化道后隨即到達(dá)動(dòng)物腸道內(nèi)。由于枯草芽孢桿菌本身屬于好氧菌群，在進(jìn)入到動(dòng)物腸道后，內(nèi)生孢子由休眠態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛钴S態(tài)的過(guò)程中會(huì)消耗大量游離態(tài)氧氣，進(jìn)而創(chuàng)造出一個(gè)有利于有益厭氧菌生長(zhǎng)而不利于好氧菌生長(zhǎng)繁殖的低氧微環(huán)境[2],與此同時(shí)，內(nèi)生孢子還產(chǎn)生了對(duì)致病菌有明顯拮抗作用的多種抗生類(lèi)物質(zhì)[3]，進(jìn)而維持腸道微生態(tài)平衡。Guo等[4]通過(guò)以不同劑量的枯草芽孢桿菌去飼喂蛋雞，實(shí)驗(yàn)證明乳酸桿菌和雙歧桿菌等厭氧菌菌群顯著增加，而好氧菌大腸桿菌數(shù)量顯著減少；陳兵等[5]通過(guò)研究口服了枯草芽孢桿菌后的大白鼠1周后糞便中厭氧菌和好氧菌落數(shù)量變化，結(jié)果顯示為腸道厭氧菌菌群數(shù)量增多，好氧菌菌群數(shù)量則明顯減少。

1.2 提升機(jī)體免疫水平

劉學(xué)劍[6]提出，枯草芽孢桿菌具有一定免疫調(diào)節(jié)活性，改善免疫功能，增加T、B淋巴細(xì)胞的數(shù)量，增加抗病能力。張愛(ài)武等[7]認(rèn)為這是因?yàn)檠挎邨U菌改善了動(dòng)物體免疫器官的發(fā)育?？莶菅挎邨U菌還可以通過(guò)自身產(chǎn)生的胞外抑菌物質(zhì)與病原菌爭(zhēng)奪附著位點(diǎn)，進(jìn)而減少細(xì)胞免受病原菌的侵害。Inooka等[8]通過(guò)使用107CFU·g-1劑量的枯草芽孢桿菌飼喂雛雞，通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明雞脾臟中的T、B淋巴細(xì)胞數(shù)量顯著增加；Ducle等[9]通過(guò)將枯草芽孢桿菌的表面抗原加入到小鼠體內(nèi)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明小鼠的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫球蛋白IgG，同時(shí)使巨噬細(xì)胞中促炎細(xì)胞因子IL-6數(shù)量降低。

1.3 誘導(dǎo)抗性與促生作用

土壤中存在一類(lèi)定殖于植物根際的有益微生物，我們將其稱為植物根際促生菌(PGPR)，它可以在減少植物病害發(fā)生的同時(shí)促進(jìn)植物的生長(zhǎng)[10]。B.subtilis是植物根際促生細(xì)菌(PGPR)的主要菌類(lèi)之一，可產(chǎn)生類(lèi)似植物生長(zhǎng)激素、細(xì)胞分裂素等代謝物質(zhì)，促進(jìn)植物快速發(fā)育，增強(qiáng)植株抗性從而提高抗病力，有效抵抗病原物的侵害。Ryu 等[11]從植物根圍分離出一株枯草芽孢桿菌 HK-CSM-1，經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)證明 HK-CSM-1對(duì)由Colletotrichumpanacicola誘發(fā)的人參炭疽病有很多的拮抗效果，同時(shí)對(duì)人參接種枯草芽孢桿菌之后，其體內(nèi)的Colletotrichumpanacicola的數(shù)量有明顯降低 ，這種現(xiàn)象與化學(xué)殺真菌劑albesilate 殺菌效果相似。B.subtilisTR21菌株能夠拮抗眾多病原真菌，在溫室和大田栽培種植條件下，都能誘導(dǎo)香蕉產(chǎn)生抗性，較好的預(yù)防香蕉枯萎病發(fā)生。湯浩等[12～14]等以巴西蕉為材料，運(yùn)用半定量RT-PCR方法，以香蕉25 S信使基因?yàn)閮?nèi)標(biāo)，用TR21菌液灌根接種處理后，檢測(cè)香蕉根系PAL、POD、PR-3和PR-1四種與抗病性相關(guān)的基因表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)接種處理后，這四種抗病基因的平均表達(dá)量都增加了，但PAL和POD基因的表達(dá)增幅明顯高于PR-3和PR-1基因，并且PAL和POD抗病基因在接種培養(yǎng)了12 h之后的表達(dá)量達(dá)到最高。從而證明B.subtilisTR21菌株是通過(guò)系統(tǒng)誘導(dǎo)香蕉抗病性來(lái)預(yù)防枯萎病的。Walia 等[15]從番茄根際土壤中分離了一株具有促生性能的菌株 N11，經(jīng)鑒定為枯草芽孢桿菌菌株 CKT1，該菌株顯示出植物生長(zhǎng)促進(jìn)活性，即溶磷，產(chǎn)鐵載體、吲哚乙酸和氫氰酸。盆栽試驗(yàn)表明，該菌株可導(dǎo)致株高、根長(zhǎng)和番茄幼苗的枝條和根的干物質(zhì)產(chǎn)量顯著增加。黃媛媛[16]以枯草芽孢桿菌 SL-44對(duì)象，研究發(fā)現(xiàn)在辣椒植物生長(zhǎng)發(fā)育中，枯草芽孢桿菌 SL-44對(duì)立枯絲核菌具有體外抑制作用，此外，SL-44 具有產(chǎn)嗜鐵素、固氮和分泌 IAA 的能力，IAA產(chǎn)量最高達(dá)到 7.5 μg·mL-1。SL-44 具有定殖在植物根圍的能力，并能夠與植物發(fā)生互作。因此，SL-44對(duì)辣椒植物具有生防和促生的作用，并可作為生物防治土傳病害的潛在制劑用于促進(jìn)作物的增產(chǎn)。

2 枯草芽孢桿菌應(yīng)用情況

2.1 枯草芽孢桿菌在生物保鮮中的應(yīng)用

2.1.1 果品保鮮中的應(yīng)用

枯草芽孢桿菌具有抗逆能力強(qiáng)、易于繁殖，代謝產(chǎn)物豐富，抗菌譜廣，對(duì)人畜高度安全等特點(diǎn)，加之收獲后果品貯藏條件的可控性，用于果品生物防腐(病原性腐爛)具有特殊優(yōu)勢(shì)。1986年，Charles L.Wilson 、P.Lawrence Pusey和李富新[17]等 用B.subtilisB-3菌株制劑處理桃、李和杏等多種成熟后的新鮮水果，有效地控制了由褐腐病致病菌Moniliniafructicola引起的腐爛病，其效果與市面上的優(yōu)良?xì)⒕鷦┬Ч嗨啤?Vapinder 和Deverall 兩位學(xué)者[18]用從柑桔果實(shí)上分離到的枯草芽孢桿菌抗生體制劑有效地控制了由鏈格孢霉、地霉屬、指狀青霉等致病菌引起的柑桔果腐病，防效達(dá)60%以上。楊佐忠[19]用B. subtilis PRS5菌劑防治收獲后柑橘果實(shí)腐爛病，獲得與相關(guān)化學(xué)保鮮劑(殺菌劑)相當(dāng)之效果。劉浩強(qiáng)，李鴻筠等[20]研究了生物源保鮮劑枯草芽孢桿菌對(duì)錦橙采后主要病菌的毒性及對(duì)錦橙果實(shí)的貯藏保鮮效果。結(jié)果表明:枯草芽孢桿菌可濕性粉劑2000倍液對(duì)青霉病、綠霉病、炭疽病等總病害均有較好的防治效果,而對(duì)果實(shí)品質(zhì)的影響和清水對(duì)照比較沒(méi)有差異性,并且對(duì)外觀色澤和口感沒(méi)有負(fù)面影響。說(shuō)明枯草芽孢桿菌可濕性粉劑2 000倍液對(duì)錦橙儲(chǔ)藏保鮮效果較好。

2.1.2 鮮切花保鮮中的應(yīng)用

以枯草芽孢桿菌制劑為材料，王澄澈等[21]對(duì)月季、高勇[22]等對(duì)波斯菊，朱天輝等[23]對(duì)除蟲(chóng)菊等鮮切花卉進(jìn)行生物保鮮試驗(yàn)，均可不同程度延長(zhǎng)鮮切花的觀賞期。25℃條件下，0.5%～1.0%的B.subtilisPRS5發(fā)酵制劑可有效延長(zhǎng)月季和波斯菊鮮切花的保鮮期，濃度高于1.0%時(shí)會(huì)對(duì)鮮切花產(chǎn)生明顯毒害作用。低濃度(<1%的發(fā)酵濃度)的B.subtilisPRS5制劑可明顯延長(zhǎng)除蟲(chóng)菊的花期(10 d)。

2.2 枯草芽孢桿菌在動(dòng)物養(yǎng)殖中的應(yīng)用

枯草芽孢桿菌菌體生長(zhǎng)過(guò)程中，一方面通過(guò)產(chǎn)生的枯草菌素、短桿菌肽等活性物質(zhì)，在動(dòng)物消化道代謝過(guò)程中可合成多種營(yíng)養(yǎng)素如氨基酸、多肽、促生長(zhǎng)因子和多種維生素等，這些養(yǎng)分可直接被機(jī)體利用。 在腸道中能夠產(chǎn)生乙酸、丙酸和丁酸等揮發(fā)性脂肪酸，降低腸道pH值，抑制病原菌生長(zhǎng)，為有益菌的增殖創(chuàng)造有利條件，間接抑制其它致病菌生長(zhǎng)[24～26]。

此外，枯草芽孢桿菌菌體自身合成α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶等酶類(lèi)，在消化道中與動(dòng)物體內(nèi)的消化酶類(lèi)一同發(fā)揮作用，能合成維生素B1、B2、B6、煙酸等多種B族維生素，提高動(dòng)物體內(nèi)干擾素和巨噬細(xì)胞的活性。還可分泌其他多種酶類(lèi)如麥芽糖酶、植酸酶和纖維素酶等，有助于降解植物性飼料中某些抗?fàn)I養(yǎng)因子，補(bǔ)充動(dòng)物內(nèi)源酶的不足，通過(guò)分泌有益活性代謝物質(zhì)改善腸道形態(tài)和促進(jìn)消化酶分泌來(lái)提高飼糧養(yǎng)分的利用率，基于這些特性，枯草芽孢桿菌被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)[27～30]。比如，納豆枯草芽孢桿菌喂食牛犢后，可在其腸胃中生長(zhǎng)，分泌各種維生素、生長(zhǎng)激素和各種活性酶，促進(jìn)牛犢腸胃黏膜細(xì)胞的分裂增殖，增強(qiáng)各種消化酶的活性，同時(shí)抑制腸胃中各種病菌發(fā)育，增強(qiáng)牛犢的抗逆性[31]。納豆枯草芽孢桿菌被農(nóng)業(yè)農(nóng)村部列為可直接飼養(yǎng)喂食動(dòng)物的12種飼料級(jí)微生物添加劑之一。

枯草芽孢桿菌在動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)中發(fā)揮著極其重要的作用。枯草芽孢桿菌也被運(yùn)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖上的應(yīng)用領(lǐng)域[1]。其作用機(jī)理是枯草芽孢桿菌被投入到水中之后，快速分裂繁殖，產(chǎn)生的細(xì)胞外活性酶可分解水底淤泥及水中的有機(jī)物，既可防止水域營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩，又能清除一部分淤泥。

2.3 枯草芽孢桿菌在農(nóng)作物病蟲(chóng)防治中的應(yīng)用

目前，在農(nóng)林病蟲(chóng)害多種綠色防控措施中，生物防治手段因環(huán)境友好性和可持續(xù)效果好，備受青睞。出于食品安全與環(huán)境保護(hù)需要，隨著國(guó)家近年來(lái)陸續(xù)出臺(tái)的化學(xué)農(nóng)藥減量或高毒農(nóng)藥限用、禁用等政策加速實(shí)施，眾多農(nóng)藥生產(chǎn)廠家以枯草芽孢桿菌拮抗體為主體的生物農(nóng)藥(制劑)登記產(chǎn)品大幅增加。

美國(guó)研發(fā)的B．subtilisvar．a(chǎn)myloliquefaciensFZB24，澳大利亞研發(fā)的B.subtilisA213，日本研發(fā)的B．subtilisRB-14和中國(guó)研發(fā)的B．subtilisB916、B908、B3、B903、XM16等菌株[32]相繼實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。胡清玉等[33]研究發(fā)現(xiàn)，以枯草芽孢桿菌為主要菌群和鉀肥聯(lián)用可增強(qiáng)蘋(píng)果樹(shù)的樹(shù)勢(shì)，顯著降低腐爛病病疤復(fù)發(fā)率；翟世玉等[34]研究發(fā)現(xiàn)鉀和枯草芽孢桿菌聯(lián)用對(duì)黑腐皮菌的抑菌效果。陳中義于2002年還將兩個(gè)含有 CrylAc 基因的穿梭表達(dá)質(zhì)粒載體，導(dǎo)入到枯草芽孢桿菌B916菌株，獲得了全新基因工程菌 Bs2249和Bs2014，這兩個(gè)基因菌在防病及殺蟲(chóng)方面都具有良好的效果。商業(yè)化產(chǎn)品“百泰天贊好”的核心菌株B.subtilisY1336，不僅對(duì)水稻、小麥、蔬菜等多種農(nóng)作物真菌病害有優(yōu)異防效，在種群的定殖過(guò)程中，自身會(huì)分泌一定量植物生長(zhǎng)素，刺激作物生根、分蘗、出芽等過(guò)程，從而改善植物生長(zhǎng)狀況，提高品質(zhì)和產(chǎn)量。Zohora 等[35]分離出的枯草芽孢桿菌RB14能定殖在番茄的根表，并在番茄生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮促生作用，可促進(jìn)番茄種子的發(fā)芽，將其發(fā)芽率提高至99%，同時(shí)對(duì)番茄植物猝倒病(Rhizoctonia solani K1)有明顯的預(yù)防效果，可降低植物病發(fā)率高達(dá)80%。楊佐忠[36]通過(guò)不同制劑及其處理方法研究枯草芽孢桿菌對(duì)杉苗猝倒病的防效，試驗(yàn)表明，在兩種試驗(yàn)環(huán)境下杉苗猝倒病均有減輕，枯草芽孢桿菌在室內(nèi)滅菌和田間自然土中的防效均優(yōu)于五氯硝基苯。

3 展望

枯草芽孢桿菌作為一種安全、高效、環(huán)保、功能多樣的細(xì)菌，是一種具有極高研究開(kāi)發(fā)潛力的微生物菌種，日益成為眾多生物科技工作者關(guān)注熱點(diǎn)。目前其已在生物農(nóng)藥和生物肥料領(lǐng)域初步實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，因其代謝產(chǎn)物的多功能性，也在農(nóng)林植物培育與保護(hù)、畜牧飼料、食品加工、環(huán)境保護(hù)等眾多領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。同時(shí)對(duì)枯草芽孢桿菌及其近緣種中拮抗基因的克隆及其表達(dá)調(diào)控等方面的探索及研究取得了突破性的進(jìn)展，其中有的已應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。但是，對(duì)枯草芽孢桿菌的研究還需在以下幾個(gè)方面開(kāi)展系統(tǒng)深入的研究：

(1)與國(guó)際研究水平相比，我國(guó)在對(duì)枯草芽孢桿菌基因組和蛋白質(zhì)組學(xué)方面的研究還需深入研究。

(2)枯草芽孢桿菌益生作用的機(jī)制相對(duì)復(fù)雜，目前還不能完全闡述清楚; 同時(shí)，其是否具有潛在的安全性問(wèn)題還需深入的研究。

(3)在枯草芽孢桿菌產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)及應(yīng)用方面暴露出很多問(wèn)題，例如相關(guān)產(chǎn)品容易受外界環(huán)境影響、作用對(duì)象單一、有效期短、見(jiàn)效速度慢等缺點(diǎn)，還需進(jìn)一步深入研究解決。

(4)枯草芽孢桿菌在養(yǎng)殖業(yè)中的研究已經(jīng)獲取很多實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，但由于枯草芽孢桿菌種類(lèi)繁多，發(fā)酵產(chǎn)物的需求不同，發(fā)酵時(shí)間存在一定差異，導(dǎo)致生產(chǎn)不穩(wěn)定、成本高等問(wèn)題而不能廣泛應(yīng)用在飼料中，因此對(duì)降低發(fā)酵成本、縮短發(fā)酵周期、穩(wěn)定生產(chǎn)等方面還需進(jìn)一步深入研究解決。