黃承敏，肖 茜，王蓉蓉，劉成國，姚 慧，周 輝*

（1.湖南農業(yè)大學 食品科學技術學院 湖南省食品科學與生物技術重點實驗室，湖南 長沙 410128；2.湖南南山牧業(yè)有限公司，湖南 城步 422512）

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是一類能夠利用可發(fā)酵糖產生大量乳酸的細菌的通稱，作為公認安全的益生菌，乳酸菌可促進腸道有益微生物的生長，對腹瀉、腸易激癥、過敏、乳糖不耐癥、刺激反應等均有一定的功效[1]，因而在工業(yè)、農業(yè)、醫(yī)學等領域有著重要的應用價值。而許多乳酸菌的益生作用與其所產生的胞外多糖有著密切的關系。乳酸菌胞外多糖（lactic acid bacteria-exopolysaccharide，LAB-EPS）是一些特殊微生物在生長代謝過程中分泌到細胞壁外、滲透到培養(yǎng)基中、易與菌體分離的一類多糖類化合物，對微生物的生長有重要意義[2-3]。

胞外多糖是一種由重復單元和分支所組成的高分子量多糖，在保護微生物抵御脫水、營養(yǎng)缺乏、有毒物質、噬菌體、滲透壓和拮抗物等不利條件時有重要作用[4]。諸如黃原膠、硬葡聚糖、結冷膠、熱凝多糖、右旋糖苷、短梗霉多糖、細菌纖維素等胞外多糖都已經成功地應用于食品、醫(yī)學、制藥、化妝品及石油行業(yè)中[5-6]。根據(jù)存在位置的不同，LAB-EPS可以分為兩種：莢膜多糖（capsular polysaccharides，CPS）和粘多糖（slimepolysaccharide，SPS），但這兩種多糖因為結合在一起很難區(qū)分而統(tǒng)稱為胞外多糖[7-8]。從化學組成上，乳酸菌胞外多糖可分為同型多糖（homopolysaccharides，Ho PS）和雜多糖（heteropolysaccharides，He PS）兩種類型，在過去的10年里，Ho PS是研究最為廣泛的一類LAB-EPS[9-10]。近年來，胞外多糖已成為乳酸菌資源開發(fā)利用中的研究熱點，但是由于某些產胞外多糖微生物的產量較低，胞外多糖的應用受到限制，所以提高微生物胞外多糖產量至關重要。目前，通過優(yōu)良高產菌株的篩選、改良菌株和優(yōu)化發(fā)酵條件等方法能在一定程度上提高微生物胞外多糖的產量[11-12]。

剁辣椒屬于傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜，其傳統(tǒng)加工方法是利用乳酸菌的自然發(fā)酵和食鹽保存作用進行加工處理，目前從剁辣椒中分離出的乳酸菌主要是植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、短乳桿菌（Lactobacillus brevis）、戊糖片球菌（P ediococcus pentosaceus）等，但主要以乳桿菌為主[13-15]。本研究旨在從自然發(fā)酵剁辣椒中篩選出高產胞外多糖的乳酸菌菌株，利用形態(tài)觀察、生理生化試驗結合分子生物學方法對其進行鑒定，并初步探討了不同碳源、時間對乳酸菌產胞外多糖的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

自然發(fā)酵剁辣椒：食品微生物實驗室自制，制作方法參照文獻[15]。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS固體培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g、牛肉粉5.0 g、酵母粉4.0 g、檸檬酸三銨2.0 g、葡萄糖20.0 g、吐溫80 1.0 mL、乙酸鈉5.0 g、磷酸氫二鉀2.0 g、硫酸鎂0.2 g、硫酸錳0.05 g、瓊脂15.0 g、蒸餾水1 L，pH 6.4、121 ℃滅菌15 min。

MRS液體培養(yǎng)基：MRS固體培養(yǎng)基中不添加瓊脂。

1.1.3 試劑

硫酸、苯酚、無水乙醇、三氯乙酸等：均為國產分析純試劑；細菌基因組（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：天根生化科技有限（北京）有限公司；

1.2 儀器與設備

TF-FD-1L冷凍干燥機：上海拓紛機械設備有限公司；HR/T16M臺式高速冷凍離心機：湖南赫西儀器裝備有限公司；GZ-400-S生化培養(yǎng)箱：韶關市廣智科技設備有限公司；101型電熱鼓風干燥箱：北京市永光明醫(yī)療儀器廠；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；V-5000可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；AG 22331 Hamburg聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增儀：德國Eppendorf公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 產胞外多糖乳酸菌的篩選

稱量25 g自然發(fā)酵的剁辣椒，加入225 mL無菌生理鹽水中，搖勻并制備梯度稀釋液，吸取合適稀釋度的稀釋液0.1 mL涂布于MRS固體平板，37℃培養(yǎng)48 h。觀察并記錄菌落特征。用無菌移液器槍頭輕輕挑取單菌落，觀察有無連續(xù)的拉絲。將有連續(xù)拉絲的單菌落挑取至MRS平板上進行劃線純化，純化得到的單菌落進行保存。

1.3.2 胞外多糖的提取及測定

（1）胞外多糖的提取[16]

將初篩得到的菌株Y-20活化后，轉接至MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h，取培養(yǎng)液于冷凍離心機中10 000 r/min、4℃離心10 min，去菌體，沸水浴5 min，冷卻至室溫，加80%三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）至終濃度為10%，充分攪拌后靜置30 min，10 000 r/min離心10 min，取上清液。將上清液移至燒杯中，加3倍體積的體積分數(shù)為95%的乙醇，4℃醇沉過夜，多糖呈絮狀沉淀析出，于4℃、10 000 r/min條件下離心10 min，去上清，將沉淀溶于10 mL蒸餾水中，裝入透析袋，透析2 d，每8 h換一次水，得胞外粗多糖水溶液。

（2）胞外多糖的測定[17]

取25 mL帶塞試管，分別吸取100μg/mL葡萄糖標準液0、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.4 mL、1.6 mL、1.8 mL、2.0 mL于每支試管中，蒸餾水補足至2 mL，然后分別加入2 mL 6%苯酚溶液，搖勻，然后迅速加入濃硫酸10 mL，立即搖勻，室溫靜置30 min，在波長490 nm處測定各反應液的吸光度值，以葡萄糖系列質量濃度（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線。

在帶塞試管中加入胞外粗多糖水溶液2 mL，另取2 mL蒸餾水作為空白對照，然后分別加入6%苯酚溶液2 mL，搖勻后迅速加入濃硫酸10 mL，立即搖勻，室溫靜置30 min，在波長490 nm處測定各溶液的吸光度值，按照葡萄糖標準曲線回歸方程計算胞外多糖的含量。

1.3.3 菌株的鑒定

（1）形態(tài)觀察

將篩選得到的菌株純化后轉接至MRS固體培養(yǎng)基上，觀察菌落的形態(tài)、大小、透明度、色澤、致密度、邊緣情況；挑取單菌落進行革蘭氏染色、鏡檢，觀察菌株的顏色、形狀、有無芽孢情況[18]。

（2）生理生化鑒定

對篩選得到的乳酸菌進行碳源利用試驗、產酸產氣試驗、硝酸鹽還原試驗、淀粉水解試驗、明膠液化試驗[19]。

（3）分子生物學鑒定

按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取乳酸菌的基因組，以其為模板進行16S rDNA PCR擴增。PCR擴增引物：正向引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）；反向引物1541R（5′-AAGGAGGTGATCCAGCC-3′）。PCR擴增體系參照文獻[15]。PCR擴增條件：95℃預變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min 30 s，30次循環(huán)；72℃再延伸10 min。PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠檢驗合格后送至華大基因科技有限公司進行測序。測定后的結果登陸美國國立生物技術信息（national center for biotechnology information，NCBI）進行Blast比對，采用Mega軟件中的鄰接法（neighbor joining，NJ）構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.4 碳源種類對菌株Y-20產EPS的影響

用MRS培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中的葡萄糖分別用等質量的葡萄糖、D-果糖、蔗糖、α-乳糖、麥芽糖替換，培養(yǎng)基滅菌后，按3%（V/V）接種量接種活化后的菌株Y-20，37℃培養(yǎng)48 h，測定發(fā)酵液中胞外多糖含量。探討培養(yǎng)基中不同碳源對菌株Y-20胞外多糖產量的影響。

1.3.5 培養(yǎng)時間對菌株Y-20產EPS的影響

按3%接種量接種活化后的菌株Y-20至MRS液體培養(yǎng)基中，37℃條件下進行靜置培養(yǎng)，每間隔4 h測定菌液在波長600 nm處的吸光度值，同時測定發(fā)酵液中的胞外多糖含量。

2 結果與分析

2.1 篩選結果

從自然發(fā)酵剁辣椒中篩選出一株疑似產胞外多糖的乳酸菌Y-20，根據(jù)葡萄糖標準曲線（y=0.681 5x-0.027 7，R2=0.996 1）測得菌株Y-20所產胞外多糖的產量為213 mg/L，通過與已報道文獻[2-3]的比較，菌株Y-20所產胞外多糖的含量較高。

2.2 菌株Y-20的鑒定

2.2.1 形態(tài)觀察

菌株Y-12的菌落形態(tài)和細胞形態(tài)見圖1。

圖1 菌株Y-20在MRS瓊脂培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)（A）及細胞形態(tài)（B）Fig.1 Colony morphology(A)and cell morphology(B)of strain Y-20 on MRS agar medium

由圖1A可知，菌株Y-20的菌落呈圓形、凸起、微白色、濕潤、邊緣整齊、不透明，直徑為3 mm左右，菌落背面為黃色。由圖1B可知，菌株Y-20無芽孢、革蘭氏染色陽性、桿菌。因此，初步鑒定為一株乳酸菌。

2.2.2 生理生化鑒定結果

菌株Y-20過氧化氫酶試驗和硝酸鹽還原試驗呈陰性、不能液化明膠、不產生硫化氫氣體、能在pH 4.5的MRS液體培養(yǎng)基中生長、能水解淀粉。菌株Y-20的碳源利用試驗結果見表1。

表1 菌株Y-20的碳源利用試驗結果Table 1 Carbon source utilizing test results of strain Y-20

由表1可知，菌株Y-20能利用阿拉伯糖、木糖、核糖、葡萄糖、甘露糖、果糖、半乳糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、棉籽糖、甘露醇、山梨醇、水楊苷、葡萄糖酸鈉；不能發(fā)酵纖維二糖、松三糖、菊粉、肌醇、七葉苷、扁桃苷。根據(jù)文獻鑒定標準[8]，初步鑒定菌株Y-20為乳酸桿菌屬（Lactobacillus）。

2.2.3 分子生物學鑒定

菌株Y-20的16S rDNA基因PCR擴增結果見圖2。

圖2 菌株Y-20的16S rDNA PCR擴增產物電泳圖Fig.2 Electrophoretogram of PCR amplification products of 16S rDNA of strain Y-20

由圖2可知，PCR擴增得到的基因片段大小在1 500 bp左右，與預測基因相符。將PCR擴增產物進行測序，測序結果登錄NCBI網站進行Blast序列比對，選取同源性較高的菌株構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果見圖3。

圖3 基于16S rDNA序列菌株Y-20的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain Y-20 based on 16S rDNA sequences

由圖3可知，菌株Y-20與植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）聚于一支，結合形態(tài)觀察及生理生化試驗的結果，鑒定菌株Y-20為一株植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。

2.3 碳源種類對菌株Y-20產胞外多糖的影響

碳源不僅可以為微生物的生長提供重要的碳素來源和能量來源，而且不同的碳源對微生物EPS的產量影響很大[20]。5種碳源對菌株Y-20產EPS的影響如圖4所示。

由圖4可知，當麥芽糖作為碳源時，菌株Y-12的胞外多糖產量最高，為221.38 mg/L，其次為葡萄糖，胞外多糖產量為217.12 mg/L，添加α-乳糖和D-果糖時，多糖的產量分別為214.04 mg/L和177.95 mg/L。

圖4 不同碳源對菌株Y-20胞外多糖產量的影響Fig.4 Effect of different carbon sources on the yield of extracellular polysaccharide by strain Y-20

2.4 不同培養(yǎng)時間對菌株Y-20產胞外多糖的影響

菌株Y-20的生長曲線及不同時間對菌株Y-20產EPS的影響結果見圖5。

圖5 菌株Y-20的生長曲線及胞外多糖產量Fig.5 Growth curve and extracellular polysaccharide yield of strain Y-20

由圖5可知，菌株Y-20的延滯期較短，培養(yǎng)3 h以后開始進入對數(shù)生長期，逐漸產生EPS，11 h以后開始進入穩(wěn)定期，穩(wěn)定期較長（≥10 h），EPS含量逐漸增加并趨于穩(wěn)定，培養(yǎng)16 h時菌體密度達到最大（3.62），EPS產量最高（242.95 mg/L）。

3 結論

本研究從自然發(fā)酵的剁辣椒中篩選出1株高產胞外多糖的乳酸菌菌株Y-20，經形態(tài)觀察及生理生化鑒定和分子生物學鑒定，鑒定菌株Y-20為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。該菌產胞外多糖的最佳碳源為麥芽糖，菌株Y-20生長16 h時，菌體密度達到最大值（OD600nm值3.62），胞外多糖產量最高，為242.95 mg/L。為進一步開發(fā)利用乳酸菌菌種資源奠定一定的理論基礎。