曾子毅，丁詩瑤，盧向陽，姚 慧，王蓉蓉，肖 茜，劉成國，周 輝*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院 湖南省食品科學(xué)與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128；3.湖南南山牧業(yè)有限公司，湖南 城步 422512）

β-葡萄糖苷酶是一類可以催化水解芳香基或烴基與糖基之間糖苷鍵的酶[1]。β-葡萄糖苷酶最早在苦杏仁汁中被發(fā)現(xiàn)，該酶廣泛分布于細(xì)菌、真菌和植物中。國內(nèi)有許多學(xué)者從不同的生物體內(nèi)提取、分離和純化了該酶，并對其酶學(xué)特性進(jìn)行了研究，不同生物體內(nèi)提取的酶的最適溫度與pH都不盡相同，但最適溫度大多在20～60℃，最適pH都在3.5～6.0[2-4]。在水果蔬菜中，存在大量的以β-D-葡萄糖苷形式存在的非揮發(fā)性風(fēng)味前體物質(zhì)，如果采用β-葡萄糖苷酶進(jìn)行果蔬汁的處理，可提高風(fēng)味物質(zhì)含量，從而大大改善產(chǎn)品的風(fēng)味[5]。如在葡萄酒釀造過程中，葡萄酒或葡萄汁中的芳香化合物通常與糖結(jié)合形成非揮發(fā)性的糖苷，可被酒酒球菌（Oenococcus oeni）中的β-葡萄糖苷酶進(jìn)行酶解轉(zhuǎn)化，從而釋放一系列萜類等香氣化合物[6-7]。劉歡等[8]研究發(fā)現(xiàn)，β-葡萄糖苷酶對“雙優(yōu)”山葡萄酒香氣成分具有顯著的影響；方可等[9]研究發(fā)現(xiàn)，β-葡萄糖苷酶可有效提升速溶烏龍茶水溶液的花香、果香及青草香；產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的菌株有釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）[10]、液化沙雷菌屬[11]、乳酸菌[12]等。β-葡萄糖苷酶還被廣泛應(yīng)用于水解大豆異黃酮苷，大豆異黃酮苷具有許多有益的生物活性，其結(jié)構(gòu)與雌激素相似，攝入體內(nèi)后能與雌激素受體結(jié)合，調(diào)節(jié)人體內(nèi)雌激素水平[13]。攝入足夠量的大豆異黃酮可以有效降低患骨質(zhì)疏松癥、婦女更年期綜合癥、高膽固醇癥、以及心血管疾病和癌癥的風(fēng)險(xiǎn)[14]。

乳酸菌是自然發(fā)酵果蔬中的優(yōu)勢微生物，對發(fā)酵果蔬品質(zhì)和風(fēng)味的形成具有重要的作用。其中植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）是發(fā)酵果蔬中最常見的乳酸菌，除了具有復(fù)雜的抵御不良環(huán)境的反應(yīng)機(jī)制外，如耐酸、耐鹽、耐氧化等反應(yīng)機(jī)制，植物乳桿菌基因組中還具有大量編碼碳水化合物利用的酶系基因，如β-葡萄糖苷酶、淀粉酶、單寧酶等[15]。關(guān)于植物乳桿菌中β-葡萄糖苷酶的研究已有報(bào)道，根據(jù)菌株的來源不同，其酶的分泌位置及酶活大小存在較大的差異性[16-20]。本研究以從自然發(fā)酵剁辣椒中分離出的4株植物乳桿菌為研究對象[20]，以植物乳桿菌1.3919作為對照，采用分光光度法比較了這5株植物乳桿菌產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的特性，試驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步闡明植物乳桿菌在發(fā)酵果蔬品質(zhì)形成中的作用機(jī)制，同時為積極開發(fā)利用產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的植物乳桿菌奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）1.3919、W-4、Y-12、Y-20、Y-22：均為實(shí)驗(yàn)室保存菌種。

1.1.2 化學(xué)試劑

對硝基苯-β-D-葡萄糖苷（p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside，p-NPG）（純度98%）、對硝基苯酚（p-nitrophenol，p-NP）（純度99.5%）：美國AMRESCO公司；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g/L，牛肉浸粉5.0 g/L，酵母浸粉4.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，磷酸氫二鉀2.0 g/L，檸檬酸三銨2.0 g/L，醋酸鈉5.0 g/L，硫酸鎂0.2 g/L，硫酸錳0.05 g/L，吐溫80 1.0 g/L，蒸餾水1 000 mL，121℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

DNP-9272BS-Ⅲ型生化培養(yǎng)箱：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；UV1750紫外分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司；普光HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋：上海浦東物理光學(xué)儀器廠；LDZX-50FBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；雷磁pHs-3C pH計(jì)：上海精科儀器有限公司；1510型全波長酶標(biāo)儀：賽默飛世爾科技有限公司；Avanti J-26XP型高速離心機(jī)：美國貝克曼庫爾特公司；Scientz-IID超聲波細(xì)胞破碎儀：寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌株活化及種子液的制備

將保存的植物乳桿菌以2%（V/V）的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)24 h，備用。將活化后的植物乳桿菌菌液以2%（V/V）的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)24 h，作為種子液。

1.3.2 胞內(nèi)、胞外粗酶液的制備

將種子液以1%（V/V）的接種量接種于裝液量為50 mL/200 mL MRS液體培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng)12 h，取培養(yǎng)液于4℃、5 000 r/min條件下離心10 min后，上清用于測定胞外β-葡萄糖苷酶活力。菌體沉淀用生理鹽水洗滌2次之后，懸浮于2 mL、pH=5的乙酸-乙酸鈉緩沖液中，再于超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)中，冰浴條件下進(jìn)行超聲破碎，超聲功率130 W，破碎總時間設(shè)定為15 min，間隔時間2 s。先破碎完的細(xì)胞破碎液暫時放置于冰箱中冷藏保存，防止酶活力大量喪失。待全部破碎完后，于4℃、12 000 r/min的速度離心10 min。取上清液，用于測定胞內(nèi)β-葡萄糖苷酶活力；再取細(xì)胞破碎液的離心沉淀，用pH=5.0的乙酸-乙酸鈉緩沖液洗滌2次后，懸浮于1 mL、pH=5.0的緩沖液中，之后吸取100μL懸浮液于試管中，用于測定細(xì)胞膜上β-葡萄糖苷酶活力。

1.3.3 胞內(nèi)β-葡萄糖苷酶活力的測定

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取69.5 mg對硝基苯酚，加熱水充分溶解后，冷卻至室溫，定容于500 mL容量瓶中，準(zhǔn)確吸取該溶液0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL于6個10 mL容量瓶中，用1 mol/L碳酸鈉溶液定容后，以1 mol/L碳酸鈉溶液作為空白對照，于400 nm波長條件下測定紫外吸光度值。以p-NP質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)繪制對硝基苯酚（p-NP）標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（2）樣品中胞內(nèi)β-葡萄糖苷酶活力的測定

取100μL胞內(nèi)粗酶液于干凈試管中，加入1.8 mL、pH=5.0的乙酸-乙酸鈉緩沖液，以加入100μL緩沖液代替粗酶液的試管作為空白對照，兩組處理于37℃恒溫水浴箱中恒溫水浴5 min，然后加入100μL，20 mmol/L的反應(yīng)底物對硝基苯-β-D-葡萄糖苷，反應(yīng)10 min后加入1 mL、1 mol/L的碳酸鈉溶液終止反應(yīng)，待冷卻至室溫后，將反應(yīng)液于400 nm條件下測定其吸光度值。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算樣品中胞內(nèi)β-葡萄糖苷酶活力。

β-葡萄糖苷酶活力單位定義：在37℃，pH 5.0條件下，每分鐘催化生成1 nmol的對硝基苯酚所需的酶量為一個酶活單位（U）。

1.3.4 胞外β-葡萄糖苷酶活力的測定

將1.3.2中的菌液離心上清液作為粗酶液，空白對照為加熱使酶失活的離心上清液，按照1.3.3中方法測定β-葡萄糖苷酶活力，反應(yīng)時間改為4 h。胞外酶的酶活力單位定義為37℃，pH 5.0條件下，每小時催化生成1 nmol/L的對硝基苯酚所需的酶量為一個酶活單位（U）。

1.3.5 菌體干質(zhì)量測定

準(zhǔn)確稱量空離心管的質(zhì)量，然后分別準(zhǔn)確吸取一定體積的植物乳桿菌培養(yǎng)液于離心管中，4℃、5 000 r/min條件下離心10 min，去上清后，將離心管置于恒溫干燥箱中烘干至恒質(zhì)量，測定離心管的質(zhì)量，離心管前后質(zhì)量之差即為該菌一定體積菌液的干質(zhì)量。

1.3.6 胞內(nèi)β-葡萄糖苷酶特性

（1）最適反應(yīng)溫度

分別設(shè)定酶解反應(yīng)溫度為25℃、30℃、37℃、44℃、51℃、58℃，其余條件同1.3.3，終止反應(yīng)待冷卻至室溫后，于波長400 nm條件下測定其吸光度值，計(jì)算得到比酶活，計(jì)算公式如下：

（2）最適反應(yīng)pH

分別配制pH為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0的乙酸-乙酸鈉緩沖液，于試管中加入100μL各菌的粗酶液，以加入100μL緩沖液代替粗酶液作為空白對照，并在各試管中分別加入不同pH的緩沖液1.8 mL，其余條件同1.3.3，終止反應(yīng)待冷卻至室溫后，于波長400 nm條件下測定其吸光度值。

（3）不同含量氯化鈉對胞內(nèi)β-葡萄糖苷酶活性的影響

取100μL粗酶液于試管中，加入1.8 mL、氯化鈉含量分別為0、5%、10%的乙酸-乙酸鈉緩沖液，以加入100μL含對應(yīng)濃度氯化鈉的緩沖液代替粗酶液作為空白對照，其余條件同1.3.3，終止反應(yīng)待冷卻至室溫后，于波長400 nm條件下測定其吸光度值，計(jì)算β-葡萄糖苷酶的活力。未添加氯化鈉緩沖液的測定結(jié)果為U o，含5%或10%氯化鈉緩沖液的測定結(jié)果為U i，其抑制率計(jì)算公式如下：

（4）不同含量乙醇對胞內(nèi)β-葡萄糖苷酶活性的影響

取100μL粗酶液于試管中，加入1.8mL、乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為0、5%、10%、15%的乙酸-乙酸鈉緩沖液，以加入100μL緩沖液代替粗酶液作為空白對照，其余條件同1.3.3，終止反應(yīng)待冷卻至室溫后，于波長400 nm條件下測定其吸光度值，計(jì)算β-葡萄糖苷酶的活力。未添加乙醇緩沖液的吸光度值為U o，含5%、10%、15%乙醇緩沖液的吸光度值為U i，β-葡萄糖苷酶抑制率計(jì)算公式如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 p-NP標(biāo)準(zhǔn)曲線

以β-葡萄糖苷酶酶解產(chǎn)物p-NP質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

由圖1可知，對硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=0.180 7x+0.035 6，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 7，表明二者具有良好的相關(guān)性，該標(biāo)準(zhǔn)曲線可用于后續(xù)酶活力的測定。

圖1 對硝基苯酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of p-nitrophenol

2.2 胞內(nèi)β-葡萄糖苷酶活力測定結(jié)果

β-葡萄糖苷酶在5株植物乳桿菌胞內(nèi)不同部位的酶活測定結(jié)果見表1。

表1 5株植物乳桿菌胞內(nèi)不同部位的β-葡萄糖苷酶的測定結(jié)果Table 1 Determination results ofβ-glucosidase from different parts in cells of 5 L actobacillus plantarum strains

由表1可知，完整細(xì)胞的酶活力最高（12.85～93.71 U/mL），其次是細(xì)胞破碎液的沉淀（3.72～58.84 U/mL），而細(xì)胞破碎液的上清中酶的活性最低（0.07～0.57 U/mL），由此可知，5株植物乳桿菌的β-葡萄糖苷酶均主要位于細(xì)胞膜上，原生質(zhì)體中幾乎無該酶存在，目前發(fā)現(xiàn)多數(shù)植物乳桿菌的胞內(nèi)β-葡萄糖苷酶位于細(xì)胞膜上[3]。但是相比于完整的細(xì)胞，盡管實(shí)驗(yàn)過程中已經(jīng)盡力去保證酶活力不喪失，其酶活力仍然普遍大幅降低，可能的原因是脫離了細(xì)胞的有機(jī)環(huán)境之后，某些細(xì)胞中含有的對酶催化作用有重要的作用的輔基等物質(zhì)就缺失了，另外超聲波破碎對于本質(zhì)是蛋白質(zhì)的β-葡萄糖苷酶具有損傷作用，所以導(dǎo)致酶活力的下降。

2.3 胞外β-葡萄糖苷酶活力測定結(jié)果

5株菌產(chǎn)胞外β-葡萄糖糖苷酶活力測定結(jié)果見圖2。

由圖2可知，5株植物乳桿菌中，菌株W-4和1.3919的胞外酶活力（＞16 U/mL）相對較高，其余3株菌胞外酶活力（＜7.5 U/mL）較低，由于本試驗(yàn)中5株植物乳桿菌的培養(yǎng)時間相同，并未對其進(jìn)行細(xì)胞數(shù)或干質(zhì)量的測定，因此試驗(yàn)結(jié)果只能簡單分析這5株植物乳桿菌的胞外酶活力。相對于胞內(nèi)酶，胞外β-葡萄糖苷酶的活性要低很多。

圖2 植物乳桿菌的胞外β-葡萄糖苷酶活力Fig.2 Extracellularβ-glycosidase activity of Lactobacillus plantarum

2.4 胞內(nèi)β-葡萄糖苷酶的最適反應(yīng)溫度

5株植物乳桿菌粗酶液在不同溫度條件下β-葡萄糖苷酶活力測定結(jié)果見圖3。

圖3 不同溫度條件下的β-葡萄糖苷酶活力Fig.3β-glycosidase activities under different temperature conditions

由圖3可知，菌株W-4、Y-12所產(chǎn)的β-葡萄糖苷酶最適反應(yīng)溫度在37℃，菌株Y-20、Y-22和菌株1.3919所產(chǎn)的β-葡萄糖苷酶最適溫度在30℃，試驗(yàn)結(jié)果與目前廣泛認(rèn)為該酶的最適溫度大多在20～60℃的結(jié)論相符合。

2.5 胞內(nèi)β-葡萄糖苷酶的最適反應(yīng)pH

5株植物乳桿菌粗酶液在不同pH條件下β-葡萄糖苷酶活力測定結(jié)果見圖4。

圖4 不同pH條件下的β-葡萄糖苷酶活力Fig.4β-glycosidase activities under different pH conditions

由圖4可知，菌株W-4和菌株Y-12所產(chǎn)的β-葡萄糖苷酶最適pH為4.5，菌株Y-20和1.3919所產(chǎn)的β-葡萄糖苷酶最適pH均為5.5，菌株Y-22所產(chǎn)的β-葡萄糖苷酶最適pH為5.0。也與目前普遍認(rèn)為該酶的最適pH在3.5～6.0，屬于酸性蛋白質(zhì)的結(jié)論相符合[5]。

2.6 不同含量氯化鈉對β-葡萄糖苷酶活性的影響

不同含量氯化鈉對5株植物乳桿菌β-葡萄糖苷酶活力的影響見圖5。

圖5 不同含量氯化鈉對β-葡萄糖苷酶活力的影響Fig.5 Effect of different NaCl concentrations onβ-glycosidase activity

由圖5可知，氯化鈉對酶活力具有明顯的抑制作用，且氯化鈉含量越高，對酶活力的抑制作用越強(qiáng)。其中5%氯化鈉對菌株Y-22β-葡萄糖苷酶活力的抑制率是44%，而10%氯化鈉的抑制率則＞60%。植物乳桿菌作為腌制發(fā)酵果蔬中常見的發(fā)酵菌種，常常要耐受一定含量的氯化鈉。氯化鈉不僅抑制微生物的生長，同時還對β-葡萄糖苷酶的活力有一定的抑制作用。因此，果蔬腌制發(fā)酵時，較高濃度的氯化鈉可能會通過抑制β-葡萄糖苷酶活力來降低香氣物質(zhì)的轉(zhuǎn)化和釋放。因此，低鹽濃度的腌制有助于微生物的生長代謝，有利于果蔬中香氣物質(zhì)的釋放。

2.7 不同含量乙醇對β-葡萄糖苷酶活性的影響

不同體積分?jǐn)?shù)乙醇對5株植物乳桿菌β-葡萄糖苷酶活力的影響見圖6。

圖6 不同含量乙醇對β-葡萄糖苷酶活力的影響Fig.6 Effects of different ethanol concentrations onβ-glycosidase activity

由圖6可知，乙醇對β-葡萄糖苷酶酶活力具有明顯的抑制作用，并且乙醇含量越高，抑制作用越強(qiáng)。其中乙醇對菌株W-4、Y-12、Y-22和1.3919的抑制率較高，達(dá)到50%左右，而對菌株Y-20的抑制率較低（＜25%）。乙醇是發(fā)酵果酒中重要的微生物代謝產(chǎn)物，植物乳桿菌可參與葡萄酒釀造過程中的蘋乳發(fā)酵階段，促進(jìn)葡萄汁中香氣成分的轉(zhuǎn)化和釋放，因而對葡萄酒的品質(zhì)形成具有重要的作用[6]。因此耐受一定乙醇的β-葡萄糖苷酶對于完成蘋乳發(fā)酵，促進(jìn)葡萄酒香氣的形成具有潛在的應(yīng)用價值。因此，選育能產(chǎn)耐乙醇β-葡萄糖苷酶的微生物菌株有利于增加葡萄酒等果酒的香氣，提高產(chǎn)品的品質(zhì)。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)中使用的5株植物乳桿菌均具有β-葡萄糖苷酶活性，不同菌株間活力存在差異，條件最適時，比酶活由高到低順序?yàn)榫闣-4（14.168 U/g）＞菌株Y-12（13.015 U/g）＞菌株Y-20（11.359 U/g）＞菌株1.3919（7.029 U/g）＞菌株Y-22（4.630 U/g）。菌株W-4和1.3919具有相對較高的胞外酶活力，但是胞外酶活力要遠(yuǎn)低于其胞內(nèi)酶活力。從胞內(nèi)酶定位的結(jié)果來看，5株菌的β-葡萄糖苷酶均位于細(xì)胞膜上，原生質(zhì)體內(nèi)幾乎無酶存在。5株植物乳桿菌的最適溫度均在30～37 ℃，pH=4.0～5.5。

在實(shí)際發(fā)酵生產(chǎn)過程中，氯化鈉和乙醇常存在于乳酸菌的生存環(huán)境中。通過本次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可以看出，氯化鈉和乙醇對乳酸菌產(chǎn)出的β-葡萄糖苷酶活力具有明顯的抑制作用，且抑制作用的強(qiáng)度隨濃度提高而增強(qiáng)。因此，未來在選育果蔬發(fā)酵劑菌株時，應(yīng)考慮菌株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的耐氯化鈉和乙醇能力，β-葡萄糖苷酶耐受能力強(qiáng)的菌株更有助于果蔬中香氣前體物質(zhì)的轉(zhuǎn)化，提高產(chǎn)品品質(zhì)。

本研究證實(shí)了β-葡萄糖苷酶在植物乳桿菌中普遍存在，但該酶在細(xì)胞中的存在部位以及酶活力大小存在菌株特異性，同時也看出，植物乳桿菌β-葡萄糖苷酶的最適反應(yīng)pH非常適宜果蔬的酸性環(huán)境。對5株植物乳桿菌β-葡萄糖苷酶研究的基礎(chǔ)上，還需要結(jié)合體外香氣前體物質(zhì)的轉(zhuǎn)化研究來進(jìn)一步考察植物乳桿菌在果蔬發(fā)酵中的潛力，為開發(fā)果蔬發(fā)酵劑奠定基礎(chǔ)。