陳亞，高雅莉，李代清

P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）又稱為多重耐藥蛋白1（multidrug resistance1，MDR1），是一個(gè)分子質(zhì)量約170 ku，利用三磷酸腺苷（ATP）水解產(chǎn)生的能量將外來(lái)物質(zhì)排出細(xì)胞外的膜蛋白［1］。人類P-gp由abcb1單基因調(diào)控，嚙齒類動(dòng)物由abcb1a和abcb1b雙基因調(diào)控［2］。本研究前期實(shí)驗(yàn)表明大鼠胰島P-gp的表達(dá)主要是由abcb1b調(diào)控［3］。多數(shù)研究者認(rèn)為2型糖尿病的主要病理機(jī)制是胰島β細(xì)胞數(shù)量的減少和功能的衰竭，而美國(guó)Accili團(tuán)隊(duì)提出糖尿病中β細(xì)胞的衰竭與其去分化有關(guān)［4］。雖然P-gp研究的熱點(diǎn)主要是與其外排泵相關(guān)的腫瘤耐藥機(jī)制，但也有文獻(xiàn)報(bào)道P-gp的表達(dá)影響細(xì)胞的分化［5］。P-gp與胰島β細(xì)胞的分化有無(wú)聯(lián)系尚不清楚。本研究通過(guò)構(gòu)建INS-1細(xì)胞和SD大鼠P-gp過(guò)表達(dá)模型，探究P-gp過(guò)表達(dá)后對(duì)β細(xì)胞分化的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞、腺病毒及動(dòng)物 大鼠胰島β細(xì)胞系INS-1購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院北京協(xié)和細(xì)胞庫(kù)。重組腺病毒顆粒由上海凱基基因構(gòu)建。野生型SD大鼠購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司。轉(zhuǎn)基因大鼠（Ins2-abcb1b）由南京生物醫(yī)藥研究院造模，所有動(dòng)物均為雄性，10～12周，體質(zhì)量250～300 g。

1.1.2 試劑 RPMI-1640購(gòu)于美國(guó)GIBCO公司；澳洲胎牛血清購(gòu)于依科賽生物公司；膠原酶Ⅴ、β巰基乙醇、青鏈霉素混合液購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；E.Z.N.A.總RNA分離試劑盒購(gòu)于美國(guó)OMEGA公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；定量PCR試劑盒（FAST SYBR Mixture）購(gòu)自生工生物工程（上海）有限公司。引物由上海英濰捷基（Invitrogen）公司合成，序列見(jiàn)表1。

Tab.1 Sequences of primers for qPCR表1 定量PCR引物序列

1.2 方法

1.2.1 INS-1細(xì)胞的培養(yǎng) RPMI-1640含10%胎牛血清，β巰基乙醇（50μmol/L），青霉素100 U/L，鏈霉素100 mg/L，置于37℃、95%O2、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。將細(xì)胞接種于6孔板，培養(yǎng)約24 h后，將Ad-abcb1b腺病毒和陰性對(duì)照病毒以濃度50×106/L感染INS-1細(xì)胞，4 h后換成正常培養(yǎng)基繼續(xù)孵育44 h，預(yù)冷PBS洗2遍后收集細(xì)胞于1.5 mL EP管中，備用。

1.2.2 大鼠胰島的摘取 取野生型和轉(zhuǎn)基因SD大鼠各5只，腹腔注射10%水合氯醛1.5～2 mL麻醉大鼠后，取仰臥位將其四肢固定于手術(shù)臺(tái)上。75%乙醇消毒皮膚后，取正中切口，暴露腹腔臟器。找到膽總管，分別在十二指腸乳頭端及近肝門(mén)處予1號(hào)絲線結(jié)扎。股動(dòng)脈放血處死大鼠，于膽總管近肝門(mén)處0.45 mm頭皮針穿刺，向胰腺內(nèi)灌注濃度為1 g/L膠原酶Ⅴ約10 mL，至胰腺完全膨脹，迅速分離胰腺，置于50 mL離心管中，37℃水浴20～25 min后，預(yù)冷Hank's液約35～40 mL終止消化，用力搖晃離心管，使胰腺組織成泥沙狀，靜置5 min（冰?。?，待其分層后棄上層液體，加入35～40 mL預(yù)冷Hank's液，洗滌2次?；靹蚝笕?～5 mL消化物于平皿中，體式鏡下手工挑揀胰島，置于裝有Hank's液的1.5 mL EP管中，備用。

1.2.3 細(xì)胞、胰島RNA萃取及基因水平測(cè)定 將收集的細(xì)胞和胰島按E.Z.N.A.總RNA分離試劑盒說(shuō)明書(shū)萃取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄條件：25℃5 min，42℃1 h，72℃5 min。定量PCR試劑盒擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性3 min；95 ℃擴(kuò)增30 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，共40個(gè)循環(huán)。熔解曲線分析：95℃ 5 s，65℃ 60 s，95℃1 s。根據(jù)qPCR得出的熒光曲線的Ct值，以 β-actin為內(nèi)參，用2-ΔΔCt計(jì)結(jié)果，ΔCt=目的基因Ct值-β-actin Ct值，ΔΔCt=P-gp過(guò)表達(dá)組ΔCt值-對(duì)照組ΔCt值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以對(duì)照組的倍數(shù)表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 統(tǒng)計(jì)分析采用GraphPad Prism 5進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2組之間均數(shù)比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 P-gp過(guò)表達(dá)對(duì)INS-1細(xì)胞分化的影響 腺病毒感染48 h后，qPCR結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組相比，P-gp過(guò)表達(dá)組Ngn3、Mafb表達(dá)量增加，而Mafa表達(dá)量明顯減低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)圖1。

Fig.1 Effects of overexpression of P-gp on the differentiation of INS-1 cells圖1 P-gp過(guò)表達(dá)對(duì)INS-1細(xì)胞分化的影響

2.2 P-gp過(guò)表達(dá)對(duì)胰島β細(xì)胞分化的影響 qPCR結(jié)果顯示，與野生型大鼠相比，P-gp過(guò)表達(dá)后，轉(zhuǎn)基因大鼠胰島組織中與胰島β細(xì)胞分化相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子的mRNA表達(dá)量均無(wú)明顯變化（P＞0.05），見(jiàn)圖2。

Fig.2 Effects of overexpression of P-gp on the differentiation of rat pancreatic β cells圖2 P-gp過(guò)表達(dá)對(duì)胰島β細(xì)胞分化的影響

3 討論

3.1 P-gp過(guò)表達(dá)可能導(dǎo)致INS-1細(xì)胞去分化 胰腺的發(fā)生發(fā)展受多種因子的共同調(diào)控，Ngn3主要是在發(fā)育中的胰腺內(nèi)表達(dá)，在其下游因子Pax-4、Mafa等的作用下，表達(dá)Ngn3的陽(yáng)性細(xì)胞分化為成熟β細(xì)胞。Mafa和Mafb是分別特異存在于β細(xì)胞和α細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子，有研究發(fā)現(xiàn)，Mafa基因敲除的小鼠表現(xiàn)為β細(xì)胞與α細(xì)胞的比率降低，譜系追蹤發(fā)現(xiàn)一部分α細(xì)胞是由β細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來(lái)，并且發(fā)現(xiàn)基因敲除鼠胰島內(nèi)的Mafb、Ngn3的表達(dá)增多［6］。這一研究說(shuō)明Mafa、Mafb、Ngn3對(duì)維持成熟β細(xì)胞的功能有重要作用。本研究結(jié)果顯示，P-gp過(guò)表達(dá)后，INS-1細(xì)胞的Ngn3、Mafb表達(dá)增加，而Mafa表達(dá)減少，說(shuō)明P-gp過(guò)表達(dá)可能導(dǎo)致INS-1細(xì)胞去分化；這與之前Samant等［7］的結(jié)果相似，他們認(rèn)為抑制MDR1的表達(dá)可以促進(jìn)前列腺上皮細(xì)胞的分化，即P-gp有抑制分化的作用。

3.2 體內(nèi)P-gp過(guò)表達(dá)對(duì)大鼠胰島β細(xì)胞的分化無(wú)影響 本研究表明，P-gp過(guò)表達(dá)后，大鼠胰島組織內(nèi)各基因表達(dá)水平無(wú)明顯差異，推測(cè)是由于大鼠體內(nèi)胰高血糖素肽-1（GLP-1）、胃泌素以及胰島內(nèi)α細(xì)胞等的作用，阻止了胰島β細(xì)胞去分化，從而維持β細(xì)胞的正常表型和功能。有人將基因改造后能分泌GLP-1的人共生菌喂養(yǎng)糖尿病大鼠，發(fā)現(xiàn)GLP-1組糖尿病大鼠的血糖明顯改善，小腸上皮細(xì)胞中出現(xiàn)分泌胰島素的細(xì)胞，并且Mafa、Pdx1的表達(dá)增加［8］。說(shuō)明GLP-1能促進(jìn)腸上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為胰島素樣細(xì)胞。另一研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病小鼠給予GLP-1干預(yù)后，與胰島β細(xì)胞分化的有關(guān)基因，如Pdx1、Neurod等的表達(dá)升高［9］。這些結(jié)果均表明GLP-1能促進(jìn)β細(xì)胞的分化。近年研究表明，GLP-1與胃泌素協(xié)同作用，共同促進(jìn)、維持β細(xì)胞的功能和增殖。Suarez-Pinzon等［10］對(duì)糖尿病小鼠分別給予GLP-1、胃泌素、GLP-1+胃泌素后發(fā)現(xiàn)，與另外兩組相比，GLP-1+胃泌素組能顯著降低小鼠血糖，且β細(xì)胞質(zhì)量增加，同時(shí)檢測(cè)到胰腺導(dǎo)管來(lái)源的胰島素陽(yáng)性細(xì)胞，這一結(jié)果也被日本科學(xué)家證實(shí)［11］。有學(xué)者認(rèn)為β細(xì)胞是由α前體細(xì)胞分化而來(lái)［12］。當(dāng)β細(xì)胞受到損傷時(shí)，體內(nèi)反饋系統(tǒng)激活，α細(xì)胞可以轉(zhuǎn)分化成為β細(xì)胞，導(dǎo)致β細(xì)胞再生增加。有研究顯示，在β細(xì)胞幾乎被破壞5個(gè)月后，實(shí)驗(yàn)小鼠可以不再依賴胰島素而存活，并且一部分小鼠血糖得到明顯改善，同時(shí)β細(xì)胞質(zhì)量較破壞初期增加數(shù)十倍，進(jìn)一步溯源發(fā)現(xiàn)這些再生的細(xì)胞并不是僅存的β細(xì)胞的復(fù)制，而是由之前存在的α細(xì)胞轉(zhuǎn)分化形成［13］。最近有一項(xiàng)研究證明分泌生長(zhǎng)抑素的胰島δ細(xì)胞與β細(xì)胞之間的旁分泌作用對(duì)維持血糖的穩(wěn)定有重要作用，消除了δ細(xì)胞的新生小鼠發(fā)生了嚴(yán)重的低血糖并很快死亡［14］。

綜上，筆者認(rèn)為INS-1細(xì)胞內(nèi)P-gp過(guò)表達(dá)可能使其去分化，而大鼠胰島β細(xì)胞中P-gp過(guò)表達(dá)對(duì)其分化無(wú)明顯影響。轉(zhuǎn)基因大鼠胰島內(nèi)Mafa、Mafb、Ngn3等因子表達(dá)水平與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異，筆者認(rèn)為可能是由于體內(nèi)各種激素、體液因子、旁分泌以及細(xì)胞之間復(fù)雜的關(guān)系所導(dǎo)致的，其具體的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。