李靜，鄭雪，丁新，向輝，陳衛(wèi)剛

肝臟疾病是我國常見病、多發(fā)病，肝硬化和肝癌是肝臟疾病重要的致死原因。肝纖維化是肝硬化和肝癌的中間環(huán)節(jié)，而抑制肝星狀細(xì)胞的激活和增殖是緩解肝纖維化的策略之一。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）是骨髓中的非造血組織，因具有自我更新、多向分化、免疫抑制等功能而成為臨床研究熱點(diǎn)［1］?，F(xiàn)越來越多的動物實(shí)驗(yàn)及臨床試驗(yàn)表明BMSCs可治療骨或軟骨損傷、心臟疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷、脊髓損傷［2］。近年來，BMSCs在肝纖維化方面的治療也取得了一定的進(jìn)展［3］，但其具體機(jī)制還不明確。本實(shí)驗(yàn)將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與肝星狀細(xì)胞（HSCs）建立間接共培養(yǎng)體系，初步探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞緩解肝纖維化的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級SD雄性大鼠，體質(zhì)量120～180 g，購自新疆維吾爾自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心；大鼠肝星狀細(xì)胞（上海富衡生物科技有限公司）；胎牛血清（美國BI公司）、L-DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司），0.25%胰蛋白酶（美國Hyclone公司），CD29-FITC抗體、CD45-FITC抗體、CD90-PE抗體（eBioscience公司）；MTT（Solarbio公司）；肝細(xì)胞生長因子ELISA試劑盒（中國Elabscience公司）；c-met抗體（MCE公司）；兔抗α-肌動蛋白（α-SMA）單克隆抗體（ab32575，Abcam公司）；熒光二抗（山羊抗兔IgG-FITC，北京中杉金橋生物科技有限公司）；PI（美國Sigma公司）；Transwell insert半透膜（0.4μm，美國Corning Costar公司）；Annexin V-PE細(xì)胞凋亡試劑盒（中國聯(lián)科生物公司）；流式細(xì)胞儀（美國BD公司）；酶標(biāo)儀（美國BIO-RAD公司）；激光共聚焦顯微鏡（德國ZEISS公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的提取、培養(yǎng)和鑒定 利用全骨髓貼壁培養(yǎng)法提取大鼠雙下肢骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，收集第2代對數(shù)生長期細(xì)胞，流式鑒定表面分子CD29、CD90、CD45；復(fù)蘇新購的HSCs，取第3代生長活躍的細(xì)胞，倒置相差顯微鏡下觀察活體細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，采用熒光免疫法檢測α-SMA的表達(dá)。

1.2.2 細(xì)胞共培養(yǎng)體系的建立及實(shí)驗(yàn)分組 6孔板半透膜（直徑0.4μm）上層每孔接種1×105個細(xì)胞，下層接種5×104個細(xì)胞/孔。實(shí)驗(yàn)分組：（1）H組，HSCs單獨(dú)培養(yǎng)（半透膜上層只有培養(yǎng)基）。（2）H-H組，HSCs和HSCs共培養(yǎng)。（3）M-H組，BMSCs與HSCs共培養(yǎng)。（4）M-H-C組，c-met抑制劑2 mmol/L預(yù)先封閉HSCs表面肝細(xì)胞生長因子（HGF）受體，4 h后BMSCs與HSCs共培養(yǎng)；48 h后倒置相差顯微鏡下動態(tài)觀察活體細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。

1.2.3 MTT法檢測HSCs增殖抑制率 各組細(xì)胞共培養(yǎng)48 h后，抽取上清液保留備用，0.25%胰酶消化貼壁細(xì)胞，用各組共培養(yǎng)上清液分別重懸各組細(xì)胞，以3 000個細(xì)胞/孔均勻接種在96孔板上，孵育4 h，向各孔加10μL MTT液，4 h后棄上清，各孔加100μL二甲基亞砜（DMSO），在酶標(biāo)儀上測定各孔在450 nm處的光密度（OD）值；細(xì)胞生長抑制率=（H組平均OD值-各處理組平均OD值）/H組平均OD值×100%。

1.2.4 共聚焦顯微鏡檢測HSCs中α-SMA的表達(dá) 各組細(xì)胞共培養(yǎng)48 h后，棄上清，4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min，0.2%Triton-X-100透膜3 min，5%BSA封閉，孵α-SMA抗體，4℃過夜，次日暗室加熒光二抗，37℃孵育1～2 h，PI染核1 min，PBS洗4次，抗熒光淬滅劑封片，即刻采用激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測HSCs凋亡率 各組細(xì)胞共培養(yǎng)48 h后，用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞，收集各組HSCs并計數(shù)，按照Annexin V-PE/7-ADD細(xì)胞凋亡試劑盒說明書操作，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.2.6 ELISA檢測共培養(yǎng)上清液HGF濃度 各孔中加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品或上下兩層共培養(yǎng)上清液，按照肝細(xì)胞生長因子ELISA試劑盒說明書嚴(yán)格操作，用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測量各孔OD值。以濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在雙對數(shù)坐標(biāo)紙上繪制四參數(shù)邏輯函數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各組細(xì)胞上清液中HGF濃度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，所有計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間多重比較采用LSD-t法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)特征及鑒定情況 原代BMSCs以集落為中心呈放射狀向周圍生長，培養(yǎng)至5～7 d時，細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的旋渦狀。BMSCs流式鑒定結(jié)果顯示，99.3%的細(xì)胞表達(dá)CD29，98.9%的細(xì)胞表達(dá)CD90，0.8%的細(xì)胞表達(dá)CD45，表明提取的原代細(xì)胞為純化的BMSCs。HSCs在倒置顯微鏡下呈星形或多邊形伸展?fàn)顟B(tài)，共聚焦結(jié)果顯示活化后的HSCs胞膜及胞漿表達(dá)α-SMA，符合實(shí)驗(yàn)要求，見圖1。

2.2 BMSCs抑制肝星狀細(xì)胞的增殖 各組細(xì)胞共培養(yǎng)48 h后顯示，BMSCs對HSCs的增殖抑制率最大，HSCs對HSCs的增殖抑制率次之，M-H-C組幾乎無抑制，M-H組與H-H組、M-H-C組相比均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見表1。

Tab.1 Effects of BMSCs on HSCs after 48-hour co-culture表1 共培養(yǎng)48 h后BMSCs對HSCs的影響 （±s）

Tab.1 Effects of BMSCs on HSCs after 48-hour co-culture表1 共培養(yǎng)48 h后BMSCs對HSCs的影響 （±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與H組比較，b與H-H組比較，c與M-H組比較，P＜0.05

組別H組H-H組M-H組M-H-C組F增殖抑制率（%，n=3）-13.46±5.75 25.41±0.89b 0.62±0.82bc 40.085＊＊α-SMA熒光強(qiáng)度（n=5）117.50±6.25 108.98±7.22 11.83±1.72ab 124.29±6.75c 401.170＊＊凋亡率（%，n=3）6.30±3.72 6.30±0.70 14.07±3.85ab 6.57±0.71c 5.963＊HGF濃度（ng/L，n=3）14.22±0.78 16.59±3.61 42.88±4.53ab 15.58±0.80c 65.006＊＊

2.3 BMSCs抑制HSCs的活性 與M-H組比較，其余3組HSCs胞膜和胞漿α-SMA表達(dá)量均增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.005），而其余3組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表1、圖1。

Fig.1 α-SMA expression of hepatic stellate cells in each group（×200）圖1 各組肝星狀細(xì)胞α-SMA表達(dá)量（×200）

2.4 BMSCs促進(jìn)肝星狀細(xì)胞的凋亡 流式結(jié)果顯示，H組、H-H組、M-H-C組HSCs凋亡率較低，且3組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，M-H組HSCs凋亡率明顯高于H組、H-H組、M-H-C組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見圖2、表1。

2.5 共培養(yǎng)上清液中HGF的濃度 ELISA結(jié)果顯示，繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線與標(biāo)準(zhǔn)相符（R2=0.99），共培養(yǎng)48 h后，M-H組上清液HGF濃度明顯高于H組、HH組、M-H-C組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見表1。

Fig.2 The image of apoptosis in hepatic stellate cells圖2 肝星狀細(xì)胞凋亡圖

3 討論

目前肝硬化患者尚缺乏有效的治療方法，干細(xì)胞因具有免疫原性低、易體外擴(kuò)增、多向分化潛能，給肝硬化患者帶來了新的希望。越來越多的研究表明干細(xì)胞移植治療可以逆轉(zhuǎn)肝纖維化和肝硬化，但具體機(jī)制尚不明確［4-5］。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，BMSCs經(jīng)尾靜脈注射入四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠體內(nèi)，肝纖維化程度降低，HSCs的數(shù)量較對照組明顯減少，凋亡率明顯增高，這為BMSCs治療肝纖維化的機(jī)制提供了新的思路［6］。HSCs經(jīng)體外傳代可被激活，活化HSCs細(xì)胞外基質(zhì)的合成和降解失衡，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)增多，從而形成纖維化。

以往研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）通過定向遷移到肝纖維化組織［7］，分化為肝樣細(xì)胞［8］，并通過抗肝細(xì)胞凋亡改善肝功能［9-10］，α-SMA是HSCs活化的標(biāo)志，MSCs可以抑制成纖維細(xì)胞的增殖和α-SMA的表達(dá)，并促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶的分泌［11］。Parekkadan等［12］在 BMSCs與HSCs共培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，BMSCs來源的白細(xì)胞介素（IL）-10和腫瘤壞死因子（TNF）-α可抑制HSCs的增殖和膠原合成。本研究發(fā)現(xiàn)BMSCs與HSCs共培養(yǎng)48 h，BMSCs會明顯抑制活化態(tài)HSCs的增殖并促進(jìn)其凋亡，且作用和上清液中HGF的濃度有關(guān)，在HGF濃度最高的M-H組中，HSCs的增殖率最低，而凋亡率最高；當(dāng)封閉HGF受體（c-met）后，增殖率升高同時凋亡率下降，說明BMSCs可能通過分泌的HGF抑制HSCs的增殖并促進(jìn)其凋亡。韋柳萍等［13］檢測了BMSCs與HSCs共培養(yǎng)24、48、72 h后HSCs的凋亡率，發(fā)現(xiàn)隨著培養(yǎng)時間的延長，HSCs的凋亡率逐漸增加，且在72 h時達(dá)到最高。然而，本研究在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，H組在培養(yǎng)72 h后，HSCs的凋亡率也明顯增高，說明此時HSCs的高凋亡率并不是由BMSCs引起的，可能是培養(yǎng)體系中未更換新的培養(yǎng)基而無法滿足HSCs的生長要求，亦或是HSCs分泌的因子引起的。Wang等［14］將BMSCs與LX2在transwell小室共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，LX2中α-SMA的表達(dá)量明顯降低，當(dāng)敲低c-met后，BMSCs不能改變活化LX2中α-SMA的表達(dá)量。本研究結(jié)果同樣也顯示，在BMSCs與HSCs共培養(yǎng)48 h后，BMSCs使活化態(tài)的HSCs活性降低，當(dāng)封閉HGF/c-met信號通路后，效應(yīng)消失，說明BMSCs可通過分泌的HGF抑制HSCs的活化。

MSCs可以旁分泌多種細(xì)胞因子，如HGF、IL-10、胰島素樣生長因子-1、神經(jīng)生長因子、血管內(nèi)皮生長因子、腫瘤壞死因子等。HGF是一種多效生長因子，在細(xì)胞的分裂、存活、遷移、形態(tài)發(fā)生等方面發(fā)揮著重要的作用。本研究在M-H組上清液中檢測到高濃度的HGF，說明BMSCs可分泌HGF。而HSCs活化后可表達(dá) HGF 受體 c-met［15］，c-met受體屬于酪氨酸激酶家族，HSCs通過分泌TNF-α、IL-6等因子刺激MSCs分泌HGF、IL-10等，HGF與HSCs表面的c-met受體結(jié)合后激活c-met位點(diǎn)，通過HGF/c-met信號通路對HSCs產(chǎn)生影響。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在HGF濃度最高的M-H組中，HSCs的凋亡率最高，HSCs的增殖和活化最低，當(dāng)封閉HGF/c-met信號通路后，效應(yīng)消失，表明BMSCs對HSCs的影響可能是BMSCs分泌HGF通過HGF/c-met信號通路起作用的。然而，HGF/c-met下游有Akt/PKB、PI3K、JNK、ERK/MAPK、PIP3等通路，具體是哪條通路起主要作用還有待進(jìn)一步研究。

此外，MSCs還可通過免疫調(diào)節(jié)和炎癥抑制的作用，抑制T、B淋巴細(xì)胞的增殖，促進(jìn)抑制性細(xì)胞因子分泌，減少炎癥性細(xì)胞因子產(chǎn)生，從而減輕肝臟炎癥反應(yīng)和肝細(xì)胞的破壞［16-17］。隨著外泌體的提出，越來越多的學(xué)者認(rèn)為MSCs改善肝纖維化與外泌體有關(guān)［18-19］。Schorey等［20］認(rèn)為外泌體為 MSCs與 HSCs間傳遞通訊的載體。Li等［21］認(rèn)為來源于人臍帶MSCs的外泌體通過抑制肝細(xì)胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、顯著恢復(fù)血清天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性，并通過降低Ⅰ/Ⅲ型膠原、轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）以及Smad2的磷酸化，使TGF-β1/Smad信號通路失活，從而改善肝纖維化。

綜上所述，BMSCs可使HSCs的增殖、活化受到抑制，凋亡增加，其機(jī)制可能是BMSCs旁分泌HGF通過HGF/c-met信號通路起作用的，這也可能是BMSCs移植治療肝纖維化的機(jī)制之一。