李 曼，任勇剛，張 淼

0引言

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病患者最常見的并發(fā)癥之一，也是成年人致盲最主要的病因之一[1]。研究結(jié)果顯示嚴(yán)格控制血糖、血壓、血脂等危險(xiǎn)因素能有效延緩和減輕糖尿病患者DR等并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展，但不能徹底阻止其發(fā)生，同時(shí)還存在部分患者代謝控制不良卻不發(fā)生DR，提示DR可能是由環(huán)境和遺傳多因素交互作用所致[2]。近年來相繼有研究發(fā)現(xiàn)維甲酸X受體基因、醛糖還原酶基因、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶基因和糖基化終末產(chǎn)物受體基因等與DR發(fā)生密切相關(guān)。越來越多研究證據(jù)表明氧化應(yīng)激可能與DR發(fā)病及進(jìn)展均密切相關(guān)[3-4]，氧化應(yīng)激可導(dǎo)致細(xì)胞膜完整性破壞，通過刺激細(xì)胞凋亡，加速微血管損害和血-眼屏障破壞，進(jìn)而參與DR的發(fā)生、發(fā)展過程。核因子E2相關(guān)因子2(NF-E2-related factor 2, Nrf2)是細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的重要保護(hù)性因子，近年來不斷有研究發(fā)現(xiàn)Nrf2-抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element，ARE)通路可能參與DR發(fā)病過程[5-6]。Xu等[7]研究發(fā)現(xiàn)Nrf2基因多個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)與糖尿病發(fā)病無明顯關(guān)聯(lián)性，但與并發(fā)癥發(fā)生密切相關(guān)。徐曉紅[8]也發(fā)現(xiàn)Nrf2基因多態(tài)性可能與糖尿病血脂異常及并發(fā)癥相關(guān)。然而，兩項(xiàng)研究均未就Nrf2基因多態(tài)性與DR易感性的相關(guān)性進(jìn)行觀察。本研究以我國(guó)陜西漢族人群為研究對(duì)象，觀察Nrf2基因多態(tài)性與DR的相關(guān)性，為臨床工作提供參考。

表1各組基本臨床特征比較

組別例數(shù)男性(例,%)年齡(x±s,歲)病程(x±s,a)BMI (x±s,kg/m2)吸煙(例,%)高血壓(例,%)使用胰島素(例,%)對(duì)照組12067(55.8)62.5±10.2-24.3±2.936(30.0)28(23.3)-DWR組18192(50.8)63.8±8.914.5±5.823.9±2.754(29.8)40(22.1)98(54.1)PDR組6238(61.3)61.5±11.115.3±5.224.1±3.321(33.9)14(22.6)35(56.5)NPDR組14387(60.8)61.8±8.514.8±4.824.5±3.150(35.0)30(21.0)80(55.9)F/χ24.0281.6110.5451.1941.2840.2180.153P0.2580.1860.5820.3120.7330.9750.926組別空腹血糖 (x±s,mmol/L)糖化血紅蛋白(x±s,%)TG(x±s,mmol/L)TC(x±s,mmol/L)LDL-C (x±s,mmol/L)HDL-C (x±s,mmol/L)對(duì)照組5.3±1.55.5±2.01.9±1.55.3±2.73.2±1.41.2±0.3DWR組8.3±2.6a7.1±2.2a2.3±1.65.5±2.43.4±1.61.2±0.3PDR組8.8±3.2a7.8±2.6a2.2±2.25.8±3.03.5±1.81.1±0.4NPDR組9.2±2.7a,c7.3±2.3a2.2±1.85.2±2.33.6±1.51.1±0.4 F60.11020.8641.1380.9841.1082.175P<0.01<0.010.3360.4020.3470.090

注：對(duì)照組：健康志愿者；aP<0.05vs對(duì)照組；cP<0.05vsDWR組。

1對(duì)象和方法

1.1對(duì)象選擇2016-01/2017-01于我科門診和(或)住院治療的2型糖尿病(diabetes mellitus type 2，T2DM)患者，T2DM診斷均符合2013年中華醫(yī)學(xué)會(huì)糖尿病學(xué)分會(huì)制定的2型糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]，且排除胰島細(xì)胞抗體，或胰島素抗體，或谷氨酰胺脫羧酶抗體陽性，以及胰島素釋放試驗(yàn)胰島素水平低下的患者。參照2014年我國(guó)糖尿病視網(wǎng)膜病變臨床診療指南[10]將T2DM組患者分為無視網(wǎng)膜病變(diabetic without retinopathy，DWR)組，增殖期DR(proliferative diabetic retinopathy，PDR)組和非增殖期DR(non-proliferative diabetic retinopathy，NPDR)組，其中DWR組共181例患者，包括男92例，女89例，平均年齡63.8±8.9歲；PDR組共62例患者，包括男38例，女24例，平均年齡61.5±11.1歲；NPDR組共143例患者，包括男87例，女56例，平均年齡61.8±8.5歲。選取同期在我院健康體檢的120例無糖尿病及視網(wǎng)膜疾病的志愿者作為對(duì)照組，其中男67例，女53例，平均年齡62.5±10.2歲。所有入組人員均為漢族，彼此無血緣關(guān)系。本研究通過本院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，所有入組成員均充分知情同意。

1.2方法臨床資料收集包括年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)、吸煙史、血壓及糖尿病病史等基本信息，也包括眼科檢查及實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果，眼科檢查包括驗(yàn)光、小孔視力及裂隙燈顯微鏡檢查，實(shí)驗(yàn)室檢查包括血糖、糖化血紅蛋白、總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)及高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)等。

基因多態(tài)性檢測(cè):采集清晨空腹時(shí)外周靜脈血用于實(shí)驗(yàn)室檢查，部分樣本采用DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司，北京)提取全血基因組DNA。采用聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)聯(lián)合DNA直接測(cè)序法檢測(cè)Nrf2基因啟動(dòng)子rs6721961位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性。PCR反應(yīng)體系(25μL)包括： 10×Buffer 2.5μL，上、下游引物各1μL(上游：5’-GGGTTCCCGTTTTTCTCCCAGCTCTGGGTG-3’；下游：5’-TGTTTGCGAAGGTCGCTGGAGTTCGGACGC-3’)，dNTP混合物2μL，TaqDNA聚合酶0.25μL，模板DNA 1μL，不足部分由滅菌蒸餾水補(bǔ)足。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性4min，然后按照變性95℃ 20s、退火65℃ 30s、延長(zhǎng)72℃ 50s的順序循環(huán)30周期，最后72℃延長(zhǎng)3min。取0.5μL延伸產(chǎn)物，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳確定，對(duì)PCR產(chǎn)物直接測(cè)序。

2結(jié)果

2.1各組間基本臨床資料比較四組的性別和年齡差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，另外在病程，BMI，吸煙，高血壓，使用胰島素情況，TG，TC，LDL-C和HDL-C等指標(biāo)四組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。DWR組，PDR組和NPDR組分別與對(duì)照組比較，空腹血糖及糖化血紅蛋白水平差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

圖1rs6721961基因型判讀。

表2各組Nrf2基因型和等位基因分布

分組例數(shù)C/CC/AA/ACA對(duì)照組12063(52.5)44(36.7)13(10.8)170(70.8)70(29.2)DWR組18198(54.1)65(35.9)18(9.9)261(72.1)101(27.9)PDR組6224(38.7)24(38.7)14(22.6)72(58.1)52(41.9)NPDR組14360(42.0)55(38.5)28(19.6)175(61.2)111(38.8)分組C/COR(95% CI)PC/AOR(95% CI)PA/AOR(95% CI)PCOR(95% CI)PAOR(95% CI)P對(duì)照組vs DWR組1.0-0.950(0.578～1.560)0.8390.890(0.480～1.943)0.7701.0-0.940(0.655～1.348)0.736對(duì)照組vs PDR組1.0-1.432(0.722～2.839)0.3032.827(1.162～6.879)0.0191.0-1.754(1.116～2.757)0.014對(duì)照組vs NPDR組1.0-1.313(0.772～2.232)0.3152.262(1.072～4.772)0.0301.0-1.540(1.068～2.221)0.020DWR組vs PDR組1.0-1.508(0.790～2.879)0.2123.176(1.386～7.275)0.0051.0-1.866(1.221～2.853)0.004DWR組vs NPDR組1.0-1.382(0.854～2.238)0.1882.541(1.295～4.983)0.0061.0-1.639(1.178～2.281)0.003PDR組vs NPDR組1.0-0.917(0.467～1.798)0.8000.800(0.360～1.776)0.5831.0-0.878(0.572～1.348)0.553

注：對(duì)照組：健康志愿者。

表3Logistic多因素回歸分析

變量BS.EWaldOR95%CIP性別1.1521.1401.0213.1640.339～29.5550.217年齡0.7110.6851.0772.0360.532～7.7960.179空腹血糖1.1360.4626.0493.1151.260～7.7030.004糖化血紅蛋白1.0370.4635.0172.8221.138～6.9930.007A等位基因0.4270.1389.5551.5321.169～2.0080.014

2.2Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)結(jié)果Nrf2基因rs6721961位點(diǎn)基因型包括C/C，C/A和A/A三種，本研究各組rs6721961位點(diǎn)基因型分布經(jīng)檢驗(yàn)均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡(P>0.05)，具有群體代表性，見圖1。

2.3各組rs6721961位點(diǎn)基因型和等位基因分布頻率及其與DR的關(guān)系DWR組與對(duì)照組比較，位點(diǎn)基因型和等位基因分布頻率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；PDR組和NPDR組分別與對(duì)照組和DWR組比較，突變純合子(AA基因型)和突變基因(A等位基因)分布頻率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。PDR組和NPDR組比較，基因型和等位基因分布頻率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

2.4Logistic多因素回歸分析將PDR組和NPDR組合并，對(duì)照組與DWR組合并，采用Logistic多因素回歸分析，校正性別、年齡、空腹血糖及糖化血紅蛋白等混雜因素，rs6721961位點(diǎn)A等位基因與DR相關(guān)(OR=1.532, 95%CI： 1.169～2.008,P=0.014)，見表3。

3討論

高血糖狀態(tài)下，蛋白激酶C途徑、多元醇途徑及氨基己糖途徑等多條途徑可被激活，使細(xì)胞氧自由基產(chǎn)生增多，同時(shí)還原性谷胱甘肽等抗氧化劑被大量消耗，機(jī)體氧化/抗氧化平衡被打亂，處于氧化應(yīng)激狀態(tài)[3-5]。視網(wǎng)膜作為一種高耗氧組織，較其他組織更容易受到氧化應(yīng)激損傷。Xu等[5]研究發(fā)現(xiàn)高糖條件下，視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞生成超氧化物明顯增多，細(xì)胞凋亡增加，加入抗氧化劑后，細(xì)胞凋亡可被抑制。還有臨床研究結(jié)果顯示DR患者血清中脂質(zhì)過氧化物水平明顯高于DWR患者，而DWR患者與正常對(duì)照組比較，血清脂質(zhì)過氧化物水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[11]。這些研究證據(jù)均提示氧化應(yīng)激在DR發(fā)生及進(jìn)展過程中發(fā)揮重要作用。

Nrf2是體內(nèi)介導(dǎo)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)最主要的細(xì)胞防御機(jī)制之一，氧化應(yīng)激刺激可激活胞漿中的Nrf2分子，促使Nrf2立即轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核內(nèi)，與ARE結(jié)合，調(diào)節(jié)下游基因表達(dá)，包括多種與機(jī)體抗氧化相關(guān)基因，發(fā)揮穩(wěn)定抗氧化作用[12]。近年來，不斷有研究發(fā)現(xiàn)Nrf2與DR密切相關(guān)，Nrf2表達(dá)減少可能是DR發(fā)病的重要原因之一，激活Nrf2表達(dá)可能是未來治療DR的重要途徑[6]。有研究發(fā)現(xiàn)Nrf2基因敲除的小鼠視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞存在退行性病理改變[13]，還有研究以Nrf2基因敲除小鼠構(gòu)建視網(wǎng)膜缺血-再灌注損傷模型，發(fā)現(xiàn)Nrf2對(duì)視網(wǎng)膜缺血-再灌注損傷具有保護(hù)作用[14]。此外，血色素氧化酶-1作為Nrf2-ARE途徑下游重要表達(dá)產(chǎn)物，也被發(fā)現(xiàn)與DR病變過程中視網(wǎng)膜神經(jīng)元損傷相關(guān)。

然而，目前關(guān)于Nrf2基因多態(tài)性與DR易感性的相關(guān)研究鮮有報(bào)道，Xu等[7-8]學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)Nrf2基因多個(gè)位點(diǎn)與糖尿病患者并發(fā)癥發(fā)生密切相關(guān)，但均未單獨(dú)就DR與Nrf2基因多態(tài)性進(jìn)行分析。本研究選擇的Nrf2基因rs6721961 C→A多態(tài)性位點(diǎn)位于啟動(dòng)子上游，可通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄的方式來影響Nrf2表達(dá)和活性，已被證實(shí)與動(dòng)脈粥樣硬化、癲癇、帕金森等多種病理改變或疾病易感性相關(guān)[15-16]。同時(shí)該位點(diǎn)在中國(guó)漢族人群中存在廣泛變異，適合作為基因多態(tài)性研究的位點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示對(duì)照組rs6721961位點(diǎn)A等位基因頻率為29.2%，與既往國(guó)人研究結(jié)果相符[15-16]。Logistic多因素回歸分析結(jié)果顯示rs6721961位點(diǎn)A等位基因均是T2DM患者發(fā)生DR的危險(xiǎn)因素，表明Nrf2基因rs6721961多態(tài)性與DR易感性密切相關(guān)，對(duì)于進(jìn)一步證實(shí)Nrf2-ARE通路在DR發(fā)病過程中的作用，同時(shí)提示對(duì)于存在rs6721961位點(diǎn)A等位基因，尤其A/A基因型的T2DM患者，更加需要注意DR的預(yù)防，加強(qiáng)血糖管理。本研究還發(fā)現(xiàn)PDR組和NPDR組rs6721961位點(diǎn)基因型和等位基因分布頻率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示rs6721961多態(tài)性可能與DR進(jìn)展過程無關(guān)，但遺憾本研究未對(duì)納入研究對(duì)象血清Nrf2水平進(jìn)行測(cè)量，無法評(píng)估Nrf2本身與DR進(jìn)展是否關(guān)聯(lián)，需要后續(xù)研究進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述，Nrf2基因rs6721961多態(tài)性可能與DR易感性密切相關(guān)，但本研究納入對(duì)象有限，需要更多相關(guān)研究結(jié)果驗(yàn)證。而且，Nrf2基因包括多個(gè)SNP位點(diǎn)，對(duì)于其他位點(diǎn)多態(tài)性與DR易感性的關(guān)系，以及多個(gè)位點(diǎn)之間的相互關(guān)系尚不明確，也需要后續(xù)進(jìn)一步研究。