秦公偉，韓豪，丁小維，，王艷龍

(1.陜西理工大學 陜西省資源生物重點實驗室，陜西 漢中 723001；2.陜西理工大學 生物科學與工程學院，陜西 漢中 723001；3.陜南秦巴山區(qū)生物資源綜合開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西 漢中 723000；4.漢中市農業(yè)科學研究所，陜西 漢中 723000)

藍莓是杜鵑花科越橘屬多年生灌木型果樹，果實中含有大量的花色苷、維生素等活性成分，享有國際糧農組織賦予的“五大健康食品”之一美譽[1]。藍莓中花色苷含量豐富，是公認的花色苷的提取源[2-3]?；ㄉ站哂卸喾N生物活性，已被應用在醫(yī)藥、日化、保健食品等多個領域，對糖尿病、視網膜病變、纖維性囊腫、視覺障礙等都有很好的療效[4-5]?；ㄉ諔脙r值非常高，果實加工中其利用率卻很低，最多達到3.3%，分析原因主要是傳統(tǒng)的提取技術耗時長，且提取不完全，還可能是提取過程中由于高溫或者其他因素破壞花色苷結構，導致提取率偏低[6]。

本文以藍莓果渣作為花色苷的提取原料，研究綠色無殘留的超臨界二氧化碳萃取技術參數，旨在為花色苷的高效利用提供技術支持。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

藍莓果渣(40 ℃恒溫干燥后粉碎，過60目篩，通風干燥處保存?zhèn)溆?，陜西定軍山藍莓科技有限公司提供；乙醇、磷酸氫二鈉、檸檬酸均為分析純；二氧化碳(99.9%)。

FW117中草藥粉末碎機；AL104電子分析天平；ST-1電熱鼓風烘箱；SCF-CO2萃取實驗裝置；UV-260紫外可見分光光度計。

1.2 藍莓果渣中花色苷的萃取

精確稱取藍莓果渣粉末50.00 g，裝至超臨界CO2萃取裝置釜中，于40 ℃萃取壓力30 MPa和CO2流率4.0 L/min萃取1.5 h。萃取完成后，降壓，分離花色苷，稱量計算得率。每次實驗均進行三次平行驗證，取平均值CO2循環(huán)使用。

2 結果與討論

2.1 萃取溫度的影響

按照1.2節(jié)的方法，探究萃取溫度對藍莓果渣中花色苷得率的影響，結果見圖1。

圖1 萃取溫度-花色苷得率關系圖Fig.1 Diagram of extraction temperature-anthocyanins yield

由圖1可知，萃取溫度升高，花色苷得率增大，40 ℃時達最大。升溫加快了花色苷分子的熱運動，有利于花色苷在超臨界二氧化碳流體中的擴散。當萃取溫度>40 ℃時，花色苷得率有減小趨勢，花色苷屬于熱敏性物質，過高的溫度會破壞其穩(wěn)定性，反而不利于萃取。選擇40 ℃為較佳的萃取溫度。

2.2 萃取時間的影響

按照1.2節(jié)的方法，探究萃取時間對藍莓果渣中花色苷得率的影響，結果見圖2。

由圖2可知，藍莓果渣中花色苷的得率隨萃取時間的增大先增大后減小，剛開始提取藍莓果渣中花色苷時，由于提取劑(超臨界CO2)和花色苷濃度差較大，推動藍莓果渣中的花色苷向提取劑中擴散，花色苷得率增大，萃取時間2.0 h時，花色苷得率最大，說明此時基本達到萃取飽和狀態(tài)，繼續(xù)增大萃取時間，花色苷得率反而降低，這可能是因為花色苷長時間處于超臨界狀態(tài)下，有小部分已經發(fā)生降解。優(yōu)選2.0 h為較佳的萃取時間。

圖2 萃取時間-花色苷得率關系圖Fig.2 Diagram of extraction time-anthocyanins yield

2.3 萃取壓力的影響

按照1.2節(jié)的方法，萃取時間2.0 h，探究萃取壓力對藍莓果渣中花色苷得率的影響，結果見圖3。

圖3 萃取壓力-花色苷得率關系圖Fig.3 Diagram of extraction press-anthocyanins yield

由圖3可知，萃取壓力升高花色苷得率提高。萃取壓力由30 MPa增大至35 MPa，花色苷得率變化很小，>35 MPa后，得率不增反減，可能是因為此時CO2的粘度過大，對傳質和提取產生了一定的副作用；再者，壓力過大也對萃取裝置提出了更高的要求。選擇30 MPa的萃取壓力較合適。

2.4 CO2流率的影響

按照1.2節(jié)的方法，萃取時間2 h，探究CO2流率對藍莓果渣中花色苷得率的影響，結果見圖4。

圖4 CO2流率-花色苷得率關系圖Fig.4 Diagram of CO2 flow rate-anthocyanins yield

由圖4可知，CO2流率增加，藍莓果渣中花色苷得率增大，CO2流率≥4.0 L/min后，花色苷得率增大幅度非常小，給萃取后CO2的分離回收利用帶來了更大的負荷，故選擇4.5 L/min的CO2流率最合適。

2.5 響應面實驗結果

在單因素實驗基礎上，通過Box-Benhnken中心組合實驗對萃取溫度、萃取時間、萃取壓力和CO2流率4個因素進行優(yōu)化，因素與水平設計見表1，結果見表2，方差分析見表3。

響應面實驗中共有27組實驗，其中 1～24為析因實驗，25～27為零點實驗，用來檢測模型的誤差。

表1 Box-Benhnken中心組合實驗設計表Table 1 Box-Benhnken center combinationexperiment design

表2 響應面實驗結果Table 2 Results of response surface method

表3 方差分析結果Table 3 Results of analysis of variance of experiment result

注：P<0.01表示極顯著，標為**，P<0.05表示顯著，標為*。

由表3可知，萃取時間(B)的影響極顯著，萃取壓力(C)的影響顯著。各因素對藍莓果渣中花色苷的提取的影響順序為：萃取時間>萃取壓力>CO2流率>萃取溫度。交互項中，萃取時間(B)和萃取壓力(C)、萃取壓力(C)和 CO2流率(D)兩組各自的交互作用對提取的影響均極顯著。

模型R2=95.57%，說明僅有4.43%不能被模型很好的預測和分析，模型的失擬項P值為0.055 4 (Pr<0.05)，不顯著，說明所建立的模型對設計涵蓋的四個因素均能很好的預測和分析，無失擬因素存在，模型的可靠性好，故此模型可用于超臨界二氧化碳萃取藍莓果渣中花色苷的預測和分析。利用模型對表2的實驗結果進行多元回歸擬合，方程如下：

Y=1.467+0.012 667A+0.094 417B+0.040 25C+0.028 833D-0.210 375A2-0.047 25AB+0.005AC-0.026 25AD-0.153 75B2-0.086 5BC+0.033 5BD-0.1C2+0.081 75CD-0.269 125D2

從擬合方程可知，所有的一次項系數均為正，說明這四個因素均對藍莓果渣中花色苷的提取存在正向作用，二次項系數均為負，因此四個因素存在一組固定值使得方程值最大。一次項前的系數越大，說明其對整個方程的結果影響越大，由方程式可知，萃取時間(B)所對應的系數值最大，萃取壓力(C)所對應的系數次之，之后為CO2流率(D)和萃取溫度(A)，這與方差分析中各因素對藍莓果渣中花色苷得率影響順序相吻合。

SAS軟件包中的程序預測所得藍莓果渣中花色苷的最高得率為1.482 194 mg/g，所對應的四個因素的最佳值為：A=-0.000 474，B=-0.285 212，C=-0.064 45，D=0.025 597，回代入表1，求得最佳工藝條件為：萃取溫度39.997 63 ℃，萃取時間1.857 394 h，萃取壓力34.677 75 MPa，CO2流率4.512 798 5 L/min。為了方便實際操作，取萃取溫度40 ℃，萃取時間1.86 h，萃取壓力34.7 MPa，CO2流率4.5 L/min，進行3次平行實驗，驗證模型預測結果的可靠性，三次平行實驗的花色苷得率分別為1.480 4，1.483 9，1.486 6 mg/g，平均值1.483 6 mg/g。與模型預測的最大得率誤差僅為0.095%，證實模型可靠，具有很好的預測效果，這對于大規(guī)模萃取藍莓果渣花色苷具有很好的指導作用，超臨界二氧化碳萃取技術綠色無污染，也利于花色苷后期的有效利用。

和文獻[1]的響應面優(yōu)化超臨界CO2萃取藍莓花色苷的得率(最優(yōu)工藝參數：萃取時間60 min，萃取溫度40 ℃，萃取壓力28 MPa，液料比為 1∶7 g/mL，花色苷得率1.58 mg/g)比較，由于本實驗采用的原料是藍莓果渣，花色苷得率略低于未加工的藍莓。藍莓加工過程中，已經有部分花色苷被帶走，因此藍莓果渣中的花色苷的提取相對來說較困難，萃取時間和萃取壓力均大于藍莓鮮果中花色苷的提取。比較得率可知，藍莓果渣中富含花色苷，將這部分資源更充分的提取和利用，可以大幅度提高藍莓的經濟價值。

2.6 花色苷紫外吸收光譜及色價測定

2.6.1 花色苷紫外吸收光譜的測定 精確稱取最優(yōu)條件下萃取的花色苷0.050 0 g，放入烘箱中，40 ℃恒溫烘干至恒重。用體積分數60%的乙醇溶解，加入一定量的pH=3的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，用體積分數60%的乙醇溶液定容至100 mL，配制標準溶液，搖勻，靜置1 h。精密量取1.00 mL放入100 mL容量瓶中，用體積分數60%的乙醇進行定容，靜置1 h，用紫外分光光度計測定花色苷溶液在200～800 nm最大吸收波長，結果見圖5[7]。

圖5 花色苷紫外吸收光譜圖Fig.5 Spectrum of anthocyanins UV absorption

由圖5可知，花色苷有兩處吸收峰，分別在280.4，530.8 nm處，530.8 nm處的吸收峰更顯著，確定為最大吸收波長，色價測定也以此作為基準。

表4 花色苷溶液色價測定結果Table 4 Color characteristic of anthocyanins solution

由表4可知，體積分數60%乙醇溶解的花色苷色價最大，90%體積分數乙醇溶解的花色苷色價最小。色價越高，說明花色苷在此溶液中越易溶解。乙醇體積分數越大，極性與花色苷的極性相差越大，花色苷越難溶解。水、體積分數60%和70%的乙醇溶液均是花色苷良好的溶劑。乙醇本身對花色苷就有一定的純化作用，可以去除花色苷中的各種雜質，蒸餾水和體積分數60%乙醇溶液溶解的花色苷的色價相差較小，說明超臨界二氧化碳萃取得到的藍莓果渣中的花色苷純度較高，有益于后期的純化精制應用。

3 結論

(1)超臨界二氧化碳萃取不使用任何有機溶劑，不會對環(huán)境產生危害，保證了花色苷的天然性，保持了花色苷的活性和固有的功效，可應用于醫(yī)藥、食品、日化等領域，萃取完成后升溫降壓，分離得到的二氧化碳能循環(huán)使用，降低提取成本，是可持續(xù)應用的高效萃取技術。

(2)超臨界二氧化碳萃取藍莓果渣中花色苷的各因素的影響順序為：萃取時間>萃取壓力>CO2流率>萃取溫度，優(yōu)化所得的最佳工藝參數為：萃取溫度40 ℃，萃取時間1.86 h，萃取壓力34.7 MPa，CO2流率4.5 L/min。此條件下，藍莓果渣中花色苷的得率達1.483 6 mg/g，與模型預測的最大得率誤差僅為0.095%。