林軍章，馮 云，譚曉明，王 靜，汪衛(wèi)東，李希明

(中國石油化工股份有限公司勝利油田分公司 石油工程技術研究院，山東 東營 257000)

引 言

微生物采油分為內源微生物采油和外源微生物采油，后者是指將具有采油功能的微生物在地面發(fā)酵后注入到油藏中進行驅油的技術，該技術主要針對內源微生物匱乏的油藏，具有目標功能菌明確的優(yōu)勢[1-6]，外源微生物油藏適應性是其能否在油藏內發(fā)揮作用的關鍵。油藏作為厭氧環(huán)境，微生物厭氧生長代謝能力決定其油藏適應性和驅油性能。前期多數外源菌采油相關性能研究都是在好氧條件下開展[7-10]，而嚴格厭氧條件下的外源菌生長代謝以及調控方法研究較少，本文以一株嗜熱特基拉芽孢桿菌為對象，對其在厭氧條件下的生長代謝及調控方法進行研究，為該類菌株在采油中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌種及來源

實驗用菌株分離自勝利油田60 °C油藏產出液中，現保存于中石化微生物采油重點實驗室的菌種保藏中心。菌株經16SDNA測序鑒定為嗜熱特基拉芽孢桿菌(Bacillustequilensis)。

1.2 培養(yǎng)基

基礎培養(yǎng)基：葡萄糖4 g/L，酵母粉1 g/L，蛋白胨 1 g/L，磷酸氫二鉀3 g/L。

優(yōu)化培養(yǎng)基：添加硝酸鈉作為電子受體，在上述基礎培養(yǎng)基中分別添加0 g/L，1 g/L，3 g/L，6 g/L的硝酸鈉。

1.3 方法

1.3.1 菌株厭氧培養(yǎng)方法

采用亨蓋特微生物厭氧操作平臺進行微生物厭氧培養(yǎng)基制備和培養(yǎng)，實驗步驟為：①在250 mL厭氧培養(yǎng)瓶中裝入100 mL培養(yǎng)基；②厭氧瓶中用高純氮氣除氧，分裝后密閉120 °C滅菌；③滅菌后培養(yǎng)基中接種5 mL菌株種子液，60 °C培養(yǎng)，不同時間取樣分析。

1.3.2 微生物生長曲線測定

不同培養(yǎng)時間取培養(yǎng)液離心，菌體重懸后利用紫外分光光度計在600 nm下測試光密度(OD)值。

1.3.3 微生物乳化能力評價

微生物乳化能力利用乳化指數方法評價，即在25 mL定量管中將微生物培養(yǎng)液樣品與柴油按照1∶1混合，振蕩器均勻振蕩3 min后靜止5 min測定乳化層高度(H1)和未乳化層高度(H2)，柴油乳化指數(R)。R=H1/(H1+H2)×100%。

1.3.4 微生物產氣量分析

先用壓力表檢測厭氧瓶上部頂空的氣體壓力p，然后通過公式n=pV/RT(n為氣體摩爾數，p為氣體壓力，V為頂空氣體體積，T為絕對溫度，R為氣體常數)計算微生物厭氧培養(yǎng)體系產氣量。

1.3.5 生物乳化劑提取方法

60 ℃培養(yǎng)48 h后，培養(yǎng)液于4 ℃、8 000 r/min 離心20 min 除去菌體后，過0.22 μm膜，上清液中加入3倍體積 4 ℃預冷的酒精，用玻璃棒攪拌均勻，置于-20 ℃ 4 h。8 000 r/min 離心2 min，沉淀用ddH2O 重懸透析后冷凍干燥，得乳化劑粗提物，20 ℃ 保存。

1.3.6 生物乳化劑種類鑒定分析

生物乳化劑粗提物分別進行糖和蛋白質定量分析，方法如下：

總糖含量測定：采用蒽酮—硫酸法[11]。

蛋白含量測定：采用考馬斯亮藍法[12]。

蛋白質電泳：采用SDS-PAGE蛋白質電泳操作方法[13]。

1.3.7 生物乳化劑結構紅外光譜分析

將溴化鉀和生物乳化劑(粗品)在研缽中磨碎，制作壓片，然后對其進行紅外光譜分析。

1.3.8 揮發(fā)性脂肪酸分析

揮發(fā)性脂肪酸分析進樣量50 μL，進樣溫度300 ℃，檢測器(FID) 溫度300 ℃，升溫程序:100 ℃(3 min)—10 ℃/min—240 ℃ (20 min)，載氣為恒流1 mL/ min 的氮氣。

1.3.9 物理模擬驅油

利用室內物理模擬實驗，考察菌株厭氧激活條件下的驅油效率。實驗模擬勝利油田沾3區(qū)塊油藏條件，實驗過程為填裝石英砂巖心，滲透率1 000×10-3μm2左右，抽真空、飽和實驗區(qū)塊的地層水，計算巖心的孔隙體積，飽和實驗區(qū)塊的脫水脫氣原油，計算巖心的原始含油量，靜置老化7 d。巖心一次水驅3倍空隙體積(PV)，一次水驅至巖心產出液含水率與實驗區(qū)塊油井平均含水率一致。注入0.3 PV菌株和營養(yǎng)劑，其中菌株培養(yǎng)液占10%，營養(yǎng)劑為葡萄糖4 g/L，酵母粉1 g/L，蛋白胨 1 g/L，磷酸氫二鉀3 g/L，硝酸鈉3 g/L，在60 ℃下恒溫培養(yǎng)15 d。注地層水開展二次水驅，待巖心出口含水率與區(qū)塊油井平均含水率一致時停止水驅，計算驅油效率，同時進行3根巖心管平行實驗。

2 結果與討論

2.1 菌株在不同條件下的生長曲線

該株嗜熱特基拉芽孢桿菌為兼性微生物，在好氧和厭氧條件下均可以生長(如圖1所示)，但從生長曲線對比發(fā)現，好氧生長速率遠高于厭氧生長速率，好氧12 h達到峰值，而厭氧需要124 h達到峰值，且好氧生長菌體量明顯高于厭氧生長的菌體量，好氧菌體OD600達到0.37，而厭氧OD600僅為0.088。厭氧生長代謝明顯弱于好氧生長代謝的原因主要是該菌株前期篩選和培養(yǎng)都是在好氧條件下進行，當從好氧生長環(huán)境轉移到厭氧生長環(huán)境后,菌株需要更長的時間適應厭氧環(huán)境。當把該菌株在厭氧環(huán)境中反復培養(yǎng)傳代5次以上，菌株在厭氧條件下的生長速率明顯提高，48 h就達到生長的最大值，比初始縮短了76 h，而且生物量也明顯提升(如圖2所示)。該研究結果表明通過好氧發(fā)酵方式生產的外源菌注入油藏后適應性弱，需要同時配注空氣來提高其油藏適應性，或者通過厭氧發(fā)酵方式生產外源菌來提高菌株的油藏適應性。

圖1 特基拉芽孢桿菌厭氧和好氧生長曲線Fig.1 Growth curves of Bacillus tequilensis under anaerobic and aerobic conditions respectively

圖2 特基拉芽孢桿菌厭氧培養(yǎng)傳代后生長曲線Fig.2 Growth curves of Bacillus tequilensis before and after subcultivation acclimation under anaerobic condition

2.2 菌株厭氧乳化特性

原油的生物乳化是重要的微生物驅油機理，而微生物對原油的厭氧乳化能力研究相對較少，本文通過對菌株的厭氧代謝乳化能力進行評價以認識其驅油潛力。研究發(fā)現，調整硝酸鹽濃度對菌株厭氧生長代謝產乳化劑方面有明顯影響，當硝酸鈉的質量濃度提高到1 g/L以上時乳化指數能達到100%，但當硝酸鈉質量濃度達到6 g/L時乳化指數反而降低，只有73%(表1)。上述實驗結果表明添加適當比例電子受體對該菌株厭氧生長代謝產乳化劑具有促進作用，但硝酸鹽濃度過高后乳化指數反而降低，這主要因為高濃度電子受體鹽度過高導致微生物代謝活性下降，該菌株合成乳化劑效率隨之降低。

表1 硝酸鈉對特基拉芽孢桿菌厭氧乳化指數的影響Tab.1 Effect of sodium acid on emulsification index of Bacillus tequilensis under anaerobic condition

2.3 菌株厭氧代謝乳化劑產物分析

該菌株厭氧培養(yǎng)液提取出的乳化劑粗提物產量約為0.75 g/L，其中總糖占生物乳化劑總量的35.1%；蛋白質占生物乳化劑總量的16.0%，由此可知該生物乳化劑主要是糖和蛋白質的聚合物。該乳化劑粗提物經蛋白酶K處理后，乳化指數變?yōu)?，說明蛋白組成部分是該類乳化劑的主要活性組分。

紅外分析發(fā)現該生物乳化劑在3 423.37 cm-1處的吸收峰為N—H的伸縮振動的強吸收峰；2 925.84 cm-1、1 311.84 cm-1和1 241.88 cm-13處的吸收峰是C—H的伸縮振動峰；1 653.52 cm-1處的吸收峰是C==O的伸縮振動引起的；1 154～1 030 cm-1范圍內存在低波數1 039.78 cm-1的強吸收，為O—H的伸縮振動的特征吸收；由紅外光譜可以看出(圖3)，該乳化劑中含有較多的—OH和RCO—NHR基團，這些基團為糖和蛋白的特征官能團。由此進一步推測糖和蛋白質為該乳化劑的主要化學組分。

通過蛋白質電泳圖(圖4)可以看出，26.0 kDa的蛋白質的條帶顏色較亮，說明組成的蛋白中存在含量較多的26.0 kDa的蛋白質。研究最多的生物乳化劑是Emulsan，其主要結構為脂多糖類[14]，另一類研究較多的生物乳化劑是Alasan，它是高分子聚糖和蛋白質的復合物，其乳化活性物質也主要是蛋白質，其中45 kDa的外膜蛋白A(OmpA)類似物前體(AlnA)是其乳化能力最強的部分[14-15]。由此推測本文菌株所產乳化劑結構與Alasan更為接近。

圖3 生物乳化劑紅外光譜圖Fig.3 Infrared spectrogram of bioemulsifier that Bacillus tequilensis produced

圖4 生物乳化劑蛋白質電泳圖Fig.4 Electrophoresis graph of protein from bioemulsifier

2.4 厭氧代謝產氣特性

微生物產氣是微生物驅油的另一個重要機理，通過產生生物氣溶解于原油可以降低原油黏度，同時提高儲層壓力，從而提高驅油效率。該菌株在厭氧環(huán)境下能夠產生生物氣，氣體組分分析發(fā)現所產生物氣為二氧化碳(表2)，而且二氧化碳含量隨著硝酸鈉質量濃度的升高而升高， 當硝酸鈉質量濃度為6 g/L時，二氧化碳產量達到7.3 mmol，說明電子受體提高了微生物的厭氧代謝活性，促進了菌株厭氧代謝產氣能力。

表2 菌株厭氧代謝產氣量和氣體組分分析Tab.2 Anaerobic metabolism gas production of strains and gas components

2.5 揮發(fā)性脂肪酸分析

乙酸、丙酸和丁酸等揮發(fā)性脂肪酸是微生物厭氧代謝重要的中間代謝產物，通常會作為油藏微生物代謝活躍程度的一個重要指標被監(jiān)測。該菌株在厭氧代謝過程中也會產生揮發(fā)性脂肪酸，隨著培養(yǎng)時間的延長其濃度不斷提高，但硝酸鈉濃度增加，所產揮發(fā)性脂肪酸的濃度反而降低，未添加硝酸鈉的樣品中脂肪酸濃度達到876 mg/L，而添加質量濃度為6 g/L硝酸鈉的樣品脂肪酸質量濃度僅為277 mg/L(表3)。這主要是由于硝酸鈉的添加促進了該菌株厭氧代謝產氣，根據物質守恒定律，在總的底物碳源不變的條件下，產氣多的樣品揮發(fā)性脂肪酸的產量就會減少。

表3 硝酸鹽對菌株厭氧代謝揮發(fā)性脂肪酸影響Tab.3 Effect of nitrate on volatile fatty acids of strains in anaerobic metabolism

2.6 菌株物模驅油效率評價

模擬勝利油田沾3區(qū)塊油藏條件，開展菌株厭氧激活驅油效率評價(圖5)。該菌株在一次水驅含水率達到95%的基礎上，采出程度從40.7%提高到46.8%，驅油效果顯著，含水率下降顯著，由95%下降到87.3%，且產出液中原油存在明顯乳化現象。以上結果說明，該菌株在油藏條件下能通過乳化和產氣等綜合作用提高水驅效率，表現出良好的應用潛力。

圖5 菌株物模驅油過程含水率和采出程度Fig.5 Variation of water cut and recovery percent with injection volume in physical simulation oil recovery of strain

3 結 論

本文研究表明特基拉芽孢桿菌作為兼性菌在好氧和厭氧條件下均可以生長代謝，厭氧條件下該菌株具有乳化、產氣和驅油能力，展現出良好的油藏適應性和采油潛力；以硝酸鈉作為電子受體的激活劑體系可以顯著提高菌株厭氧代謝活性，這為提高外源微生物在油藏厭氧環(huán)境的驅油功能提供了理論指導。