汪清銳,呂林芳

(山西省桑干河楊樹豐產(chǎn)林實(shí)驗(yàn)局，山西 大同 037000)

黑果枸杞(LyciumruthenicumMurr.)屬為茄科枸杞屬多年生多棘刺灌木植物，是我國荒漠地區(qū)特有的野生植物，主要分布在我國西北地區(qū)。黑果枸杞抗寒、抗旱、耐鹽堿、耐高溫能力強(qiáng)，是保持水土、防風(fēng)固沙的優(yōu)良植物資源。其果實(shí)富含蛋白質(zhì)、多糖、類黃酮、氨基酸、維生素及多種微量元素，藥用和保健價(jià)值遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于普通紅枸杞；還富含特有的原花青素和花青素，是天然的抗氧化劑，具有延緩衰老的作用。近年來，由于自然環(huán)境惡化和人為采伐對黑果枸杞植株的破壞，其野生群居數(shù)量和規(guī)模大面積減少，產(chǎn)量急劇下降。黑果枸杞播種繁殖常常出現(xiàn)遺傳分化，目前黑果枸杞育苗主要以嫩枝扦插為主，但扦插育苗繁殖系數(shù)低。而利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)，不僅可以保留植株原有的優(yōu)良性狀，還可以將優(yōu)良單株快速繁殖成無性系并大量擴(kuò)繁。但關(guān)于黑果枸杞組織培養(yǎng)工廠化育苗的關(guān)鍵技術(shù)尚不完善。本研究以室外成熟黑果枸杞種子為外植體，對其不定芽的誘導(dǎo)、增殖、生根進(jìn)行研究，以期建立野生黑果枸杞組織培養(yǎng)快繁技術(shù)，為大面積栽培、開發(fā)利用及保護(hù)黑果枸杞提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料為甘肅黑果枸杞雜交優(yōu)良品種種子。先用自來水沖洗20 min，用飽和肥皂水將種子浸泡10 min后沖洗干凈。放置于超凈工作臺(tái)上用75%的酒精消毒20 s，用無菌水沖洗干凈，再用0.1%氯化汞消毒5 min，期間不斷晃動(dòng)，使外植體各面都接觸到消毒液。之后再用無菌水清洗5次，獲得無菌外植體材料。

1.2 方法

1.2.1 初級(jí)培養(yǎng)

將種子接種到MS+6-BA 2.0 mg/L+IBA 0.1 mg/L，MS+6-BA 1.0 mg/L+GA30.5 mg/L，MS+6-BA 0.5 mg/L+2,4-D 0.1 mg/L 3種培養(yǎng)基中萌發(fā)無菌苗。培養(yǎng)基蔗糖用量30 g/L，瓊脂粉用量5.6 g/L，pH值為5.8(下同).每瓶接種20顆種子，每組培養(yǎng)基接種20瓶。培養(yǎng)條件：溫度為25 ℃左右，每天光照時(shí)間10 h～12 h.研究不同培養(yǎng)基對黑果枸杞種子萌發(fā)的影響。

1.2.2 愈傷組織誘導(dǎo)

將無菌苗接種到MS+6-BA 1.5 mg/L+IBA 0.1 mg/L，MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L和MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.1 mg/L 3種培養(yǎng)基中誘導(dǎo)愈傷組織。每瓶接種5株無菌苗，每組培養(yǎng)基接種20瓶，光照培養(yǎng)，比較誘導(dǎo)率，研究不同培養(yǎng)基對無菌苗誘導(dǎo)的影響。

1.2.3 增殖培養(yǎng)(不定芽分化培養(yǎng))

取長勢旺盛的愈傷組織，分割成生長狀況和大小(約1 cm3)基本一致的愈傷組織團(tuán)塊，分別接種于不同濃度6-BA(0.2 mg/L，0.4 mg/L，0.6 mg/L)和IBA(0.1 mg/L)的增殖培養(yǎng)基上。每瓶接種3塊愈傷組織團(tuán)塊，每組20瓶。光照培養(yǎng)，定期觀察生長情況，統(tǒng)計(jì)芽苗的高度和平均芽數(shù)，研究不同培養(yǎng)基對黑果枸杞愈傷組織分化不定芽的影響。在后續(xù)的繼代培養(yǎng)中，6-BA激素的濃度應(yīng)越來越低，因?yàn)樵鲋趁缰幸呀?jīng)積累了較多的 6-BA.

1.2.4 生根培養(yǎng)

剪取株高3 cm以上的增殖苗，分別接種于不同濃度 IBA(0.3 mg/L，0.5 mg/L，1.0 mg/L)和NAA(0.2 mg/L)的生根培養(yǎng)基中。每瓶接種3株無根幼苗，每組20瓶，研究不同培養(yǎng)基對黑果枸杞生根誘導(dǎo)的影響。觀察根系及小芽生長情況，15 d后記錄生根率、平均根數(shù)、平均根長。

2 結(jié)果與分析

2.1 無菌苗培育

以黑果枸杞成熟種子為外植體，進(jìn)行初代培養(yǎng)。將種子接種在MS+6-BA 2.0 mg/L+IBA 0.1 mg/L培養(yǎng)基上，形成的無菌苗玻璃化現(xiàn)象嚴(yán)重，有效發(fā)芽率為40%.在MS+6-BA 1.0 mg/L+GA30.5 mg/L培養(yǎng)基上形成的無菌苗長勢好,發(fā)芽率為80%.在MS+6-BA 0.5 mg/L+2,4-D 0.1 mg/L培養(yǎng)基上多數(shù)沒形成無菌苗，發(fā)芽率為5%.因此，誘導(dǎo)無菌苗的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L+GA30.5 mg/L，30 d后陸續(xù)發(fā)芽，獲得無菌苗。

2.2 愈傷組織形成

將無菌苗移栽到MS+6-BA 1.5 mg/L+IBA 0.1 mg/L，MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L和MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.1 mg/L培養(yǎng)基上，芽苗基部很快形成愈傷組織。在細(xì)胞分裂素(6-BA)較高的培養(yǎng)基中形成的愈傷組織較多，在MS培養(yǎng)基中加入6-BA 1.0 mg/L時(shí)愈傷組織誘導(dǎo)效果較好，可產(chǎn)生大量的綠色愈傷組織，少部分無效的黃白色愈傷組織。隨著6-BA濃度增高到1.5 mg/L，愈傷組織誘導(dǎo)率和分化率均增高，但愈傷組織玻璃化現(xiàn)象嚴(yán)重，有效不定芽數(shù)減少。6-BA濃度為0.5 mg/L時(shí)產(chǎn)生的愈傷組織較少、較小。

種子萌發(fā)產(chǎn)生的無菌苗易被誘導(dǎo)，短時(shí)間內(nèi)開始生成愈傷組織，在切口處膨大成淺綠色瘤，呈松散粒狀。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，愈傷組織大量增殖，同時(shí)顏色轉(zhuǎn)變?yōu)樯罹G色，并開始分化出綠色不定芽點(diǎn)，但5周以后愈傷組織上部出現(xiàn)黑點(diǎn)，開始老化。綜合結(jié)果，培養(yǎng)基MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L愈傷組織的誘導(dǎo)率達(dá)80%，愈傷組織生長快，增殖倍數(shù)為10倍，愈傷組織呈綠色、致密團(tuán)狀，有很多凸起，少部分玻璃化，為本試驗(yàn)誘導(dǎo)黑果枸杞愈傷組織生長的最適宜激素配比。

2.3 增殖與繼代培養(yǎng)

將愈傷組織轉(zhuǎn)接到6-BA含量不同的MS增殖培養(yǎng)基上，培養(yǎng)40 d后愈傷組織陸續(xù)長出不定芽。隨著培養(yǎng)基中6-BA濃度的增加，不定芽發(fā)生率也增加。培養(yǎng)基中6-BA濃度高于0.6 mg/L時(shí)，增殖率開始下降，且產(chǎn)生的不定芽多出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。當(dāng)培養(yǎng)基中6-BA質(zhì)量濃度為0.4 mg/L時(shí)，增殖效果最好，產(chǎn)生正常的不定芽，增殖倍數(shù)為25倍。繼代培養(yǎng)周期約為30 d，形成芽苗。在繼代培養(yǎng)過程中，當(dāng)6-BA含量逐漸降低到0.2 mg/L時(shí)，繼代培養(yǎng)效果較好。

2.4 壯苗與不定根誘導(dǎo)

當(dāng)芽苗長至5 cm～8 cm 時(shí)，將細(xì)弱的芽苗剪切成帶1個(gè)～2個(gè)腋芽的莖段，接種到MS培養(yǎng)基中進(jìn)行壯苗培養(yǎng)。3周后再選擇較粗壯的芽苗接種到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行不定根誘導(dǎo)，7 d后開始生根，突出根生長點(diǎn)，2周后陸續(xù)發(fā)生不定根。芽苗在1/2 MS+IBA 0.3 mg/L+NAA 0.2 mg/L培養(yǎng)基上生根率最高，達(dá)90%，與其它培養(yǎng)基相比差異顯著。表現(xiàn)為生根速率快，根系生長迅速，且根長勢均勻、數(shù)量多，植株最高約5 cm，健壯，葉子肥厚，深綠色。其次是1/2 MS+IBA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L培養(yǎng)基，生根率達(dá)65%.1/2 MS+IBA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L培養(yǎng)基生根緩慢，側(cè)根少或幾乎無側(cè)根，個(gè)別不生根，植株矮小，生長緩慢，且產(chǎn)生很多玻璃化苗，出現(xiàn)了部分黑果枸杞苗白化現(xiàn)象。

3 討論

黑果枸杞種子誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織直至長成完整植株的過程幾乎沒有褐化現(xiàn)象，污染極容易被控制，玻璃化是試驗(yàn)中需要克服的問題。最適宜的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L，在此培養(yǎng)基中，隨著6-BA濃度升高，愈傷組織誘導(dǎo)率升高；濃度大于1.5 mg/L時(shí)，玻璃化現(xiàn)象加重。玻璃化的發(fā)生也與培養(yǎng)瓶內(nèi)濕度密切相關(guān)，瓶內(nèi)濕度較大，在培養(yǎng)瓶上蓋凝結(jié)成小水滴，可能提高了玻璃化的發(fā)生率。適量減少細(xì)胞分裂素，降低培養(yǎng)基濕度，可以減少愈傷組織玻璃化。在培養(yǎng)基中添加NAA明顯提高了不定芽的分化率，且增殖苗顏色深綠，長勢旺盛。