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        筍芽頂端分生組織在竹稈橫切面形態(tài)形成中的作用與機(jī)制研究

        2019-02-13 11:11:16王雨珺
        世界竹藤通訊 2019年3期
        關(guān)鍵詞:筍芽原體竹筍

        王雨珺 魏 強(qiáng)

        (南京林業(yè)大學(xué)竹類研究所 南京 210037)

        竹類是一種獨(dú)特且重要的植物資源。竹筍可食,竹材可用,竹林還具有生長周期短、維護(hù)成本低等優(yōu)點(diǎn),因此具有巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。如今,全世界有近22億人口的住房、食物以及經(jīng)濟(jì)收入依賴于竹產(chǎn)業(yè);全球約有一半人口的生活和工作與竹產(chǎn)品的使用和貿(mào)易相關(guān)。目前,全球竹產(chǎn)業(yè)年貿(mào)易總額已經(jīng)超過25億美元,而人們對竹類資源的需求量仍在持續(xù)穩(wěn)步增長。要滿足人們對竹材資源日益增長的需求,就需要不斷提高竹林資源的栽培效率,提高效率的基礎(chǔ)則依賴于對這一獨(dú)特的禾本科植物生長發(fā)育的深入研究和全面認(rèn)識。

        竹稈作為竹材中最具利用價(jià)值的部分,其形態(tài)建成主要分為筍芽的分化、筍芽初生增粗生長以及竹筍的高生長3個(gè)重要階段。目前針對竹稈發(fā)育的研究大多集中在竹稈的高生長上,對筍芽增粗生長的研究極少。本團(tuán)隊(duì)前期通過對毛竹筍芽初生增粗生長過程及厚竹厚壁性狀形成機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn),筍芽頂端分生組織(SAM)的形態(tài)和尺寸對于竹稈橫切面外輪廓形態(tài)與壁-腔結(jié)構(gòu)形成具有重要的作用。

        為進(jìn)一步深入研究筍芽頂端分生組織在竹稈發(fā)育中的作用及其機(jī)制,本研究選取了20種不同稈徑的竹種,比較分析了這些竹種筍芽SAM的形態(tài)特征,并且對SAM的尺寸、細(xì)胞數(shù)以及原體/原套細(xì)胞數(shù)比值等指標(biāo)與稈徑值進(jìn)行了相關(guān)性分析。此外,我們還針對一種SAM尺寸縮小,細(xì)胞數(shù)目減少并且原體/原套細(xì)胞數(shù)目比例失調(diào)的穩(wěn)定變異體——實(shí)肚竹(Phyllostachysnidulariaf.farcta)(屬于篌竹Ph.nidularia一種厚壁型穩(wěn)定變異體)進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。

        1 材料方法與數(shù)據(jù)處理

        1.1 不同稈徑竹種萌動(dòng)芽SAM形態(tài)學(xué)比較分析

        從南京林業(yè)大學(xué)竹種園(東經(jīng)118°81′,北緯32°08′)中選取了20種不同稈徑的散生竹(1,Pleioblastusargenteastriatus; 2,Shibataeachinensis; 3,Sasaellakongosanensis‘Aureostriatus’; 4,Chimonobambusasichuanensis; 5,Phyllostachysbissetii; 6,Pseudosasaamabilis; 7,Pseudosasajaponica; 8,Pleioblastusamarus; 9,Phyllostachysarcanaf.luteosulcata; 10,Semiarundinariasinica; 11,Phyllostachysglauca; 12,Brachystachyumdensiflorum; 13,Phyllostachysnigra; 14,Pleioblastusmaculatus; 15,Phyllostachysnidularia; 16,Indosasagigantea; 17,Sinobambusatootsik; 18,Phyllostachysnigravar.henonis; 19,Phyllostachysbambusoides; 20,Phyllostachysedulis),每種竹隨機(jī)測量30根長勢中庸、無病蟲害、健康完整的一年生竹稈地徑,計(jì)算每種竹竹稈的平均地徑。隨后,挖取相應(yīng)竹種萌動(dòng)時(shí)期(S1時(shí)期)筍芽進(jìn)行石蠟切片,每個(gè)竹種取5~10個(gè)生物學(xué)重復(fù)。通過石蠟切片,我們得到以上竹種筍芽的SAM縱切面形態(tài),分別統(tǒng)計(jì)每種竹子筍芽SAM的高度、寬度、總細(xì)胞數(shù)、原套細(xì)胞數(shù)、原體細(xì)胞數(shù)以及原體/原套細(xì)胞數(shù)比值,將這些指標(biāo)與對應(yīng)竹種一年生竹稈平均地徑進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果顯示,筍芽SAM的高度、寬度、總細(xì)胞數(shù)、原套和原體部分細(xì)胞數(shù)目以及原體/原套細(xì)胞數(shù)比值均隨著稈徑的增加而呈增大的趨勢。其中,原體/原套的細(xì)胞數(shù)比值隨著SAM總細(xì)胞數(shù)目的增加呈明顯的線性增長。相關(guān)性分析顯示,以上SAM所有形態(tài)指標(biāo)與稈徑均呈顯著相關(guān),其中原體細(xì)胞數(shù)與稈徑的相關(guān)性系數(shù)最大(原文中圖1所示)。結(jié)合Photoshop CS6、MATLAB以及R軟件等分析工具,利用超橢圓方程對SAM外部輪廓進(jìn)行擬合,結(jié)果表明筍芽SAM的外部輪廓形態(tài)在20個(gè)竹種中無明顯差異,均呈指狀(原文中圖2所示)。

        1.2 實(shí)肚竹筍芽SAM形態(tài)特征分析

        選取實(shí)肚竹與其原種篌竹S1時(shí)期,S2時(shí)期(發(fā)育前期),S3時(shí)期(發(fā)育中后期)筍芽作為SAM形態(tài)學(xué)比較分析的實(shí)驗(yàn)材料。2種筍芽均采集自其原始產(chǎn)地貴州省的荔波縣(北緯25°29′,東經(jīng)107°51′)。將3個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的2種筍芽進(jìn)行石蠟切片后,得到SAM的縱向切面圖。利用超橢圓方程分別對3個(gè)發(fā)育時(shí)期的實(shí)肚竹及篌竹筍芽的SAM外部輪廓進(jìn)行擬合,發(fā)現(xiàn)2種筍芽之間以及不同發(fā)育時(shí)期筍芽之間,其SAM均具有相似的輪廓形態(tài)(原文中圖3所示)。進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)2種筍芽SAM的高度、寬度、高/寬比值、總細(xì)胞數(shù)目、原套細(xì)胞數(shù)、原體細(xì)胞數(shù)以及原體/原套細(xì)胞數(shù)比值后發(fā)現(xiàn),實(shí)肚竹筍芽SAM較其原種篌竹具有尺寸縮小(高度、寬度、高/寬比值均降低)、細(xì)胞數(shù)目顯著減少(總細(xì)胞數(shù)、原套細(xì)胞數(shù)及原體細(xì)胞數(shù)均顯著降低)并且原體/原套細(xì)胞數(shù)比值顯著降低的特點(diǎn)(原文中圖3所示)。

        1.3 實(shí)肚竹地下筍芽發(fā)育的細(xì)胞學(xué)過程

        將實(shí)肚竹與篌竹3個(gè)發(fā)育時(shí)期(S1、S2、S3時(shí)期)的地下筍芽進(jìn)行縱向石蠟切片觀察,對比分析各個(gè)發(fā)育時(shí)期兩種筍芽的細(xì)胞學(xué)特征,結(jié)果如原文圖4所示:實(shí)肚竹S1時(shí)期筍芽中髓組織分化不明顯,并且筍體中分化出了相對更多的壁組分組織(基本分生組織及肋狀分生組織)。在后續(xù)的發(fā)育時(shí)期中,實(shí)肚竹筍芽髓組織發(fā)育遲緩,并且髓組織中出現(xiàn)明顯的壁組分組織混入的紊亂現(xiàn)象(如原文圖4展示)。進(jìn)一步對實(shí)肚竹及篌竹S2時(shí)期筍芽的髓細(xì)胞進(jìn)行亞細(xì)胞觀察,發(fā)現(xiàn)其髓細(xì)胞的細(xì)胞壁形態(tài)曲折扭曲,胞間層及細(xì)胞間隙形態(tài)均發(fā)生變形(如原文圖5展示),暗示實(shí)肚竹髓組織在發(fā)育過程中受到異常機(jī)械力擠壓。

        1.4 實(shí)肚竹竹稈的形態(tài)及解剖學(xué)分析

        分別選取實(shí)肚竹與篌竹1年生成熟竹稈作為形態(tài)學(xué)及解剖學(xué)分析的實(shí)驗(yàn)材料。將竹稈每個(gè)節(jié)間的橫截面進(jìn)行掃描(如原文圖6-A,B,E展示),結(jié)果顯示實(shí)肚竹成熟竹稈節(jié)間具有多種竹壁加厚類型,一些疑似維管組織及基本組織出現(xiàn)在髓腔的中部。比較各節(jié)間橫截面上竹壁與髓腔的面積比,發(fā)現(xiàn)實(shí)肚竹竹稈各節(jié)間橫截面上的壁-腔面積比均顯著大于篌竹(如原文圖6-C展示)。利用超橢圓方程進(jìn)行竹稈橫截面外部輪廓的擬合分析,結(jié)果顯示2種竹稈橫截面外部輪廓形態(tài)相似(如原文圖6-D)。選取2種竹稈各典型節(jié)間進(jìn)行滑走切片以及掃描電鏡觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)2種竹稈典型竹壁部分的解剖結(jié)構(gòu)類似,實(shí)肚竹竹桿中的增生組織均為壁組分組織(維管組織及基本薄壁組織),但位于髓腔中部的維管組織形態(tài)發(fā)育異常(如原文圖6-E—K)。選取標(biāo)準(zhǔn)竹測量2種竹稈的稈高、枝下高、節(jié)數(shù)、胸徑、地徑、平均節(jié)間長、平均節(jié)間寬、平均壁厚、以及竹稈各部分生物量。比較結(jié)果顯示,實(shí)肚竹竹稈的生物量較篌竹顯著降低,形態(tài)學(xué)指標(biāo)中除了平均壁厚顯著高于篌竹之外,其他指標(biāo)均顯著小于篌竹(如原文圖6-L, M)。

        1.5 實(shí)肚竹與篌竹筍芽轉(zhuǎn)錄組比較分析

        選取實(shí)肚竹與篌竹S1時(shí)期筍芽作為實(shí)驗(yàn)樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,每種筍芽樣品設(shè)置了5個(gè)生物學(xué)重復(fù)。所有筍芽樣品均采集自貴州省荔波縣(北緯25°29′,東經(jīng)107°51′)。利用RNAprep Pure Kit (DP441)試劑盒對樣品進(jìn)行總RNA提取。提取到高質(zhì)量RNA后,進(jìn)行Strand-Specific RNA序列文庫的構(gòu)建和測序。利用Trimmomatic進(jìn)行數(shù)據(jù)的過濾,即去除接頭和低質(zhì)量的序列,結(jié)果生成約1.41億個(gè)高質(zhì)量的read pairs,序列大小共約38 Gb。隨后使用Bowtie將得到的序列片段(長度>40 bp)與核糖體RNA(rRNA)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對齊,刪除比對成功的片段后使用帶有默認(rèn)參數(shù)的rnaSPAdes對序列進(jìn)行重頭組裝。之后通過CD-HIT去除裝配后的冗余片段,再利用BUSCO來對裝配轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行評估,結(jié)果表明:組裝的單基因捕獲了核心保守植物基因的90.90%,完全捕獲了核心保守植物基因的77.71%。所有樣本的轉(zhuǎn)錄組譜在各個(gè)生物學(xué)重復(fù)中均具有較高的相關(guān)性(>0.9)。最后,利用BLASTx(e-value 為1e-5)在Swiss-Prot以及TrEMBL數(shù)據(jù)庫中對序列信息進(jìn)行注釋。注釋完成后,將通過RSEM(v1.2.31)獲得的轉(zhuǎn)錄本原始計(jì)數(shù)輸入edgeR包中鑒定差異表達(dá)基因(DEGs)(將P值小于0.05,表達(dá)倍數(shù)(log2)絕對值>0.5的轉(zhuǎn)錄本認(rèn)為是DEGs)。結(jié)果得到844個(gè)DEGs。這些DEGs中有343個(gè)在實(shí)肚竹S1期筍芽中顯著下調(diào),有501個(gè)顯著上調(diào)。利用MapMan(v.3.5.1R2)軟件對差異基因進(jìn)行可視化分析。結(jié)果顯示:與原種(篌竹)的S1時(shí)期筍芽相比,實(shí)肚竹筍芽中多種細(xì)胞學(xué)過程相關(guān)基因發(fā)生了顯著變化,如原文圖7中展示:大量與植物內(nèi)源激素代謝通路相關(guān)的基因,如脫落酸(ABA)、生長素(IAA)、油菜素內(nèi)酯(BR)、赤霉素(GA)、茉莉酸(JA)相關(guān)基因在實(shí)肚竹S1時(shí)期筍芽中下調(diào),而水楊酸(SA)相關(guān)基因則呈上調(diào)表達(dá)。此外,一系列與RNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)的DEGs在實(shí)肚竹中顯著下調(diào),其中KNOTTED1likehomeobox,ELONGATOR和SIZ1等轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子都曾被報(bào)道在莖頂端分生組織發(fā)育或細(xì)胞增殖和生長中發(fā)揮重要作用。此外,一些與“信號傳導(dǎo)”通路相關(guān)的DEGs也在實(shí)肚竹S1時(shí)期筍芽中顯著下調(diào),如一系列與受體激酶、磷酸肌苷和MAPK激酶信號通路相關(guān)的基因。同時(shí),如原文圖8中所示:一系列下游功能基因,如與DNA合成與修復(fù)、細(xì)胞壁合成、糖分代謝、次生代謝、氨基酸代謝以及與細(xì)胞活動(dòng)相關(guān)的基因在實(shí)肚竹筍芽中顯著下調(diào)。在脂類代謝相關(guān)途徑中,一些與脂類降解、脂肪酸合成及糖脂合成相關(guān)的基因均在實(shí)肚竹筍芽中顯著上調(diào),但其中與磷脂合成的相關(guān)基因卻在變異體中下調(diào)。此外,一系列與氮代謝和糖酵解相關(guān)基因表達(dá)量在實(shí)肚竹中顯著上調(diào)。大多數(shù)運(yùn)輸相關(guān)的基因,如糖分、磷酸鹽、金屬、鉀和主要內(nèi)在蛋白質(zhì)運(yùn)輸相關(guān)基因也在實(shí)肚竹筍芽中顯著上調(diào)表達(dá)。

        1.6 轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果驗(yàn)證

        從差異表達(dá)基因中挑選了12個(gè)候選基因進(jìn)行了qPCR驗(yàn)證。這些基因包括:3個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子KNOX1,SIZ1和ELP1;5個(gè)分別與植物內(nèi)源激素ABA、BR、GA、SA和JA信號通路相關(guān)的差異基因;1個(gè)與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的基因;1個(gè)與次生代謝相關(guān)的基因;1個(gè)與纖維素合成相關(guān)基因以及1個(gè)與糖脂類合成相關(guān)基因。利用用于測序的RNA作為模板,通過TransScript? One-step gDNA Removal and cDNA Sythesis SuperMix 試劑盒進(jìn)行cDNA的反轉(zhuǎn)錄。內(nèi)參基因選用液泡膜內(nèi)在蛋白基因Tonoplast intrinsic protein (TIP41)。qPCR驗(yàn)證結(jié)果顯示12個(gè)差異基因表達(dá)趨勢與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果一致(如原文中圖9所示)。

        委托中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物研究所對實(shí)肚竹及其原種篌竹S1期筍芽中的CKs與IAA含量進(jìn)行檢測。結(jié)果如原文圖10所示,除iPR外,實(shí)肚竹筍芽中所有檢測到的其他CKs水平均明顯低于篌竹。而IAA在實(shí)肚竹S1時(shí)期筍芽中豐度也顯著小于其原種篌竹S1時(shí)期筍芽。

        2 結(jié)論

        竹類植物維持穩(wěn)定的SAM外輪廓指狀形態(tài)可能是其產(chǎn)生圓柱形竹稈的基礎(chǔ);與此同時(shí)SAM細(xì)胞數(shù)目、原套與原體細(xì)胞數(shù)量比例在竹稈稈徑演化及正常壁-腔結(jié)構(gòu)形成上應(yīng)具有重要作用。實(shí)肚竹筍芽SAM與其原種篌竹相比,尺寸縮小、細(xì)胞數(shù)目減少,原體/原套細(xì)胞數(shù)目比例降低。這使得其由原體細(xì)胞分化而來的髓組織比例降低,而由原套細(xì)胞分化而來的壁組分組織比例增加。這2種組織比例的失衡使得壁組分組織在筍芽后續(xù)發(fā)育過程中易隨機(jī)擠入髓組織中去,最終導(dǎo)致了實(shí)肚竹稈壁增厚且壁-腔結(jié)構(gòu)多樣化性狀的形成。細(xì)胞數(shù)目減少的頂端分生組織也導(dǎo)致了實(shí)肚竹筍芽中CKs和IAA含量較低,同時(shí)一系列與激素相關(guān)基因及其下游靶標(biāo)基因的下調(diào)表達(dá)最終導(dǎo)致了實(shí)肚竹竹稈矮化、稈徑小且生物量低3種性狀的形成。一部分與SAM維持及細(xì)胞分裂相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,如KNOX1、ELPs和SIZ1在實(shí)肚竹筍芽中的下調(diào)可能是導(dǎo)致其SAM尺寸變小,細(xì)胞數(shù)目變少的分子原因。上述研究結(jié)果揭示了筍芽頂端分生組織外部形態(tài)、尺寸、細(xì)胞數(shù)目及原體/原套細(xì)胞數(shù)目比例在維持竹稈正常橫切面形態(tài)(圓形外部輪廓,稈壁圍繞髓腔呈規(guī)則環(huán)形分布的正常壁-腔結(jié)構(gòu))發(fā)育中的重要作用。此外,本研究還揭示了一系列與此過程相關(guān)的候選調(diào)控基因,為后續(xù)針對竹稈發(fā)育的深入研究奠定了較好的基礎(chǔ)。

        原 文 出 處

        Wang Y, Sun X, Ding Y,Fei Z, Jiao C, Fan M, Yao B, Xin P, Chu J, Wei Q. Cellular and molecular characterization of a thick-walled variant reveal a pivotal role of shoot apical meristem in transverse development of bamboo culm. Journal of Experimental Botany. 2019 Apr 30. doi:10.1093/jxb/erz201.

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