黃少江，閻呂軍，牛凱，李青

(陸軍軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院，重慶400037)

結直腸癌是消化道常見的腫瘤之一，目前手術切除是治療結直腸癌最有效的方式，然而只有少數(shù)早期結直腸癌患者才能采用根除手術治療[1]，且手術后的腫瘤復發(fā)率仍較高，5年生存率很低[2]。研究證實，在結直腸癌的發(fā)生發(fā)展中存在多種基因和其編碼蛋白的改變，越來越多的證據(jù)顯示長鏈非編碼RNA(LncRNA)的異常表達在結直腸癌的發(fā)生、遷移和侵襲中有重要作用[3, 4]。LncRNAs是一種長度大于200個核酸的RNA，能夠識別互補序列，在RNA的轉錄后加工過程中有重要的意義，這些轉錄后加工的過程包括剪切、編輯、轉運、翻譯以及降解[5]。研究[6, 7]顯示，LncRNA ?；撬嵘险{(diào)基因1(TUG1)在胃癌、肝癌、乳腺癌、膀胱癌等多種腫瘤中發(fā)揮調(diào)控作用。也有研究[8, 9]顯示,TUG1在結直腸癌中明顯高表達并影響結直腸癌上皮間質(zhì)轉化過程，然而其具體作用機制尚未完全明確。本研究首先觀察了LncRNA TUG1在結直腸癌細胞中的表達水平，然后探討了干擾其表達對結直腸癌細胞增殖、凋亡、侵襲、遷移的影響及機制。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑 結直腸癌細胞系SW480、HCT-116、SW620和LoVo細胞和正常結腸上皮細胞系FHC細胞購自中國科學院上海細胞生物研究所。RPMI1640和L-15細胞培養(yǎng)基、Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)；FBS(Sigma-Aldrich公司)；總RNA提取試劑盒(Takara公司)；RNA反轉錄試劑盒、SYBR Green、熒光試劑、引物(Qiagen公司)；兔抗細胞轉化生長因子-β(TGF-β)、細胞內(nèi)信號轉導蛋白2(Smad2)和α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)(Cell Signaling公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)、分組與siRNA-TUG1轉染 SW480、SW620和LoVo細胞采用含10%胎牛血清的L-15細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)；HCT-116和FHC細胞采用含10%胎牛血清的RPMI 1640細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)；放置于37 ℃、5% CO2平衡濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期觀察細胞生長情況并進行換液。將轉染siRNA-TUG1的細胞分為siRNA-TUG1組，轉染siRNA-NC的細胞分為siRNA-NC組。細胞轉染采用Lipofectamine 2000方法。轉染前1 d，分細胞至6孔板，每孔細胞數(shù)為1×106/孔，每孔中加入不加抗生素的培養(yǎng)基1.5 mL，使轉染時的細胞密度為30%～50%。其具體操作按照說明書進行。

1.2.2 結直腸癌細胞中TUG1、TGF-β、Smad2、α-SMA mRNA表達檢測 采用qRT-PCR法。按照TRIzol試劑盒步驟提取結直腸癌細胞中總RNA，使用分光光度儀檢測RNA濃度。GAPDH為內(nèi)參。qRT-PCR按照SYBR Green試劑盒說明書進行反應體系的配制，反轉錄試劑盒合成cDNA。采用比較CT值法對獲得的數(shù)據(jù)進行相對定量分析。TUG1在SW480、HCT-116、SW620、LoVo、正常結腸上皮細胞FHC中的表達分別為1.79±0.05、2.31±0.18、2.99±0.21、3.45±0.08、1.04±0.05，SW480、HCT-116、SW620、LoVo細胞中TUG1表達高于FHC細胞(P均<0.05)，SW620和LoVo細胞中TUG1的表達高于其他結直腸癌細胞(P均<0.05),SW620和LoVo細胞作為后續(xù)試驗的研究對象。

1.2.3 各組細胞增殖觀察 采用CCK-8法。取對數(shù)生長期的各組細胞，以2×103個/孔接種到96孔培養(yǎng)板中，常規(guī)培養(yǎng)。各組細胞分別培養(yǎng)24、48、72 和96 h后，加人10 μL的CCK-8溶液，孵育10 min，用酶標儀測定405 nm波長的吸光度值。

1.2.4 各組細胞遷移、侵襲能力觀察 采用Transwell法。在SW620和LoVo細胞轉染24 h后，以1×104個/孔接種于24孔板Transwell中，每組設置3個復孔，并在上室加入200 μL RPMI1640培養(yǎng)基，下室加入600 μL RPMI1640培養(yǎng)基，在37 ℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)22 h后取出上室，并吸取下室中培養(yǎng)液，加入結晶紫染色液100 μL/孔，染色10 min，PBS洗滌2遍，100倍顯微鏡下選取10個視野,計數(shù)遷移細胞,取平均值。在侵襲分析中，小室以基質(zhì)膜包被，后續(xù)試驗同遷移步驟。100倍顯微鏡下選取10個視野,計數(shù)侵襲細胞,取平均值。

1.2.5 各組細胞周期分析和凋亡觀察 采用流式細胞術。取對數(shù)生長期細胞，以3×105個/孔接種于6孔板，胰酶消化收集轉染24 h后細胞，PBS洗滌后制備成細胞懸液，加入預冷的70% 乙醇，4 ℃固定過夜。加入PBS洗滌2次后棄上清，加入PI工作液，室溫下避光孵育30 min后，流式細胞儀檢測細胞周期。用預冷的PBS洗滌2次，加入10 μL Annexin V-FITC和5 μL碘化丙啶染色液(0.25 mg/mL)，輕輕混勻，室溫避光孵育20 min，用流式細胞儀檢測凋亡細胞。

1.2.6 各組細胞培養(yǎng)液TGF-β、Smad2、α-SMA蛋白檢測 采用Western blotting法。在結直腸癌細胞中提取蛋白并進行蛋白定量，調(diào)節(jié)每份樣品蛋白濃度，在上樣緩沖液加入等量蛋白，煮沸，在SDS聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳，電轉至PVDF膜，封閉液室溫封閉3 h，分別加入TGF-β、Smad2、α-SMA和GAPDH一抗4 ℃過夜，HRP標記二抗，室溫孵育2 h，ECL發(fā)光劑檢測轉印膜上靶蛋白信號，具體操作按ECL說明書進行，然后于暗室中用膜對X線片曝光，所得X線片上的信號條帶用吸光度圖像掃描儀掃描采集圖片，采用AlphaEase FC軟件對圖片進行灰度值分析。結果以GAPDH作內(nèi)參，計算相對表達量。

2 結果

2.1 各組SW620和LoVo細胞增殖能力比較 siRNA-TUG1組SW620和LoVo細胞中TUG1的表達水平較siRNA-NC組明顯下降(0.57±0.12 vs 1.03±0.17；0.43±0.08 vs 1.00±0.18)(P均<0.05)。siRNA-TUG1組轉染24、48、72、96 h，SW620細胞增殖活性分別為0.20±0.01、0.24±0.06、0.46±0.06、0.66±0.07，LoVo細胞增殖活性分別為0.21±0.01、0.27±0.07、0.43±0.06、0.78±0.07。siRNA-NC組轉染24、48、72、96 h，SW620細胞增殖活性分別為0.20±0.01、0.35±0.07、0.68±0.13、1.14±0.11，LoVo細胞增殖活性分別為0.20±0.01、0.37±0.08、0.71±0.13、1.16±0.11。轉染96 h，siRNA-TUG1組SW620和LoVo細胞的增殖活性較siRNA-NC組低(P均<0.05)。

2.2 各組SW620和LoVo細胞侵襲和遷移能力比較 siRNA- TUG1組SW620和LoVo細胞侵襲細胞數(shù)分別為(53±5)、(61±3)個/HP，遷移細胞數(shù)分別為(84±10)、(102±8)個/HP；siRNA-NC組SW620和LoVo細胞侵襲細胞數(shù)分別為(93±6)、(99±8)個/HP，遷移細胞數(shù)分別為(165±11)、(185±15)個/HP。siRNA-TUG1組SW620和LoVo細胞的侵襲、遷移能力較siRNA-NC組下降(P均<0.05)。

2.3 各組SW620和LoVo細胞周期分布和凋亡率 siRNA-TUG1組G0/G1、M、S期SW620細胞比例分別為55.10%±3.64%、8.72%±2.20%、22.53%±1.99%，G0/G1、M、S期LoVo細胞比例分別為57.60%±3.96%、9.15%±1.95%、21.53%±2.25%；siRNA-NC組 G0/G1、M、S期SW620細胞比例分別為39.12%±2.50%、8.90%±2.00%、40.53%±2.70%，G0/G1、M、S期LoVo細胞比例分別為35.30%±2.94%、8.90%±1.80%、37.54%±2.74%。siRNA-TUG1組G0/G1期SW620和LoVo細胞比例高于siRNA-NC組(P均<0.05)，S期細胞比例低于siRNA-NC組(P均<0.05)。siRNA-TUG1組SW620細胞、LoVo細胞凋亡率分別為13.64%±1.56%、19.46%±2.41%，siRNA-NC組分別為5.93%±0.55%、7.47%±1.10%，兩組各細胞凋亡率比較，P均<0.05。

2.4 各組SW620和LoVo細胞TGF-β、Smad2、α-SMA mRNA及蛋白相對表達量比較 siRNA-TUG1組SW620細胞TGF-β、Smad2、α-SMA mRNA相對表達量分別為0.49±0.05、0.37±0.04、0.25±0.02，蛋白相對表達量分別為0.51±0.05、0.39±0.04、0.29±0.03；LoVo細胞TGF-β、Smad2、α-SMA mRNA相對表達量分別為0.64±0.07、0.47±0.05、0.38±0.04，蛋白相對表達量分別為0.62±0.06、0.51±0.05、0.43±0.04。siRNA-NC組SW620細胞TGF-β、Smad2、α-SMA mRNA相對表達量分別為0.87±0.08、0.78±0.07、0.59±0.05，蛋白相對表達量分別為0.98±0.09、0.87±0.09、0.68±0.07；LoVo細胞TGF-β、Smad2、α-SMA mRNA相對表達量分別為0.88±0.09、0.79±0.08、0.68±0.07，蛋白相對表達量分別為0.96±0.09、0.83±0.08、0.74±0.07。siRNA-TUG1組SW620和LoV細胞TGF-β、Smad2、α-SMA mRNA和蛋白表達低于siRNA-NC組(P均<0.05)。

3 討論

結直腸癌是我國常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率位居全球惡性腫瘤的第3位，近年隨著國人生活水平的提高、飲食習慣的改變、人口的老齡化以及結直腸癌普查的開展，我國結直腸癌的發(fā)病率呈明顯上升趨勢，嚴重影響人們的健康和生活質(zhì)量[10]。

LncRNAs是腫瘤研究領域的一個新的成員，研究表明其在腫瘤的發(fā)生和腫瘤的抑制通路中發(fā)揮著重要作用[11]。在結直腸癌中存在多種LncRNAs的異常表達，包括HOTAIR、PVT1、SNHG1和AB073614等[12～15]。最近有研究顯示，在結直腸癌中TUG1存在明顯高表達，不僅影響患者預后還對結直腸癌細胞的上皮間質(zhì)轉化具有重要作用[16]。本研究結果顯示，TUG1在結直腸癌細胞SW480、HCT-116、SW620和LoVo中的表達水平高于正常結腸上皮細胞FHC，說明結直腸癌細胞TUG1表達升高。進一步采用細胞實驗驗證TUG1對結直腸癌細胞的影響，采用siRNA-TUG1轉染SW620和LoVo細胞，TUG1在細胞中的表達水平明顯下降;同時低表達TUG1可以明顯抑制SW620和LoVo細胞增殖活性，侵襲和遷移能力。說明低表達TUG1可以抑制結直腸癌的進展。在腫瘤細胞中細胞的凋亡率明顯下降，因此促進腫瘤細胞的凋亡是抑制腫瘤進展的重要方式。有研究[17]顯示，抑制TUG1表達后，能夠促進腫瘤細胞的凋亡。在本研究中低表達TUG1后SW620和LoV細胞G0/G1期細胞比例明顯升高，S期細胞比例明顯下降，同時細胞凋亡率增加，說明TUG1可以將結直腸癌細胞阻滯在G0/G1期，同時誘導結直腸癌細胞的凋亡。

TGF-β在依賴Smads的信號通路中，能夠誘導Smad2、α-SMA、Snail、HMGA2、Twist和ZEB等多種分子的表達[18]。HMGA2作為細胞核蛋白，不僅能夠與細胞核內(nèi)DNA結合，還能調(diào)控多種轉錄因子的表達，其可以上調(diào)鋅指蛋白Snail和螺旋蛋白Twist的表達，Snail又能促進Slug和Twist的表達，在轉錄因子間的相互作用及調(diào)控下，能夠使細胞上皮的程序化表達抑制，促進間質(zhì)細胞的程序化表達，進而導致上皮間質(zhì)轉化[19]。有研究[20]顯示，在慢性阻塞性肺疾病中TUG1能夠通過調(diào)控TGF-β信號通路影響疾病的進展。另有研究顯示，TGF-β信號通路在腫瘤的進展中具有重要作用。本研究中采用RT-PCR和Western blotting檢測TGF-β、Smad2、α-SMA mRNA和蛋白的表達量，結果顯示SW620和LoVo細胞轉染siRNA-TUG1后，TGF-β、Smad2和 α-SMA mRNA和蛋白的表達水平較轉染siRNA-NC的細胞明顯降低，說明TUG1低表達能夠抑制TGF-β信號通路。

綜上所述，TUG1在結直腸癌細胞中明顯高表達，干擾TUG1表達可能通過抑制TGF-β信號通路激活抑制結直腸細胞增殖、侵襲、遷移，阻滯細胞周期，促進細胞凋亡。TUG1有可能成為結直腸癌治療的潛在靶點應用于臨床，這需要進一步研究探討。