胡 燕

糖尿病腎?。―N）是一種嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥，常與1型和2型糖尿病相關(guān)，是腎功能衰竭的主要原因，也是發(fā)達(dá)國(guó)家終末期腎?。‥SRD）的主要原因之一［1］。DN是由葡萄糖代謝紊亂引起的腎小球毛細(xì)血管和管狀結(jié)構(gòu)功能改變引起的進(jìn)行性腎臟疾病。腎小管間質(zhì)纖維化（ECM）被認(rèn)為是糖尿病腎病進(jìn)展的主要決定因素。盡管過去幾十年已經(jīng)在診斷和治療DN患者方面取得了重大進(jìn)展，但仍未能顯著降低這一人群的病死率，迫切需要尋找早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷和早期治療DN的生物標(biāo)志物。近幾年有關(guān)外泌體在腎臟疾病中的研究越來越多，外泌體是由細(xì)胞產(chǎn)生并存在于體液中的細(xì)胞外囊泡（EV）［2］。 外泌體含有多種生物分子，例如脂質(zhì)，蛋白質(zhì)，miRNA和mRNA，現(xiàn)已證明外泌體通過在細(xì)胞間轉(zhuǎn)移核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等特定組成從而在細(xì)胞間通訊中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，并參與多種腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展。

1 外泌體的起源及生物學(xué)特性

外泌體是由大多數(shù)細(xì)胞分泌的直徑40～100 nm的細(xì)胞外囊泡，特別是免疫系統(tǒng)細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞［3］，B 細(xì)胞［4］和 T 細(xì)胞［5］，以及間充質(zhì)干細(xì)胞［6］，內(nèi)皮細(xì)胞［7］和上皮細(xì)胞［8］。 研究證明多種癌細(xì)胞也可分泌外泌體［9］。它們可以在多種類型的細(xì)胞外液中發(fā)現(xiàn)，如血液，尿液，羊水，唾液，腦脊液，甚至母乳［10-13］。

外泌體由不同的生物分子組成，包括DNA、RNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)。在透射電子顯微鏡下，外泌體是由脂質(zhì)雙分子層組成的呈杯型的囊泡。所有外泌體都含有膜轉(zhuǎn)運(yùn)和融合蛋白（GTPases，膜聯(lián)蛋白，flotillin），tetraspannins（CD9，CD63，CD81，CD82），熱休克蛋白（Hsc70，Hsp90），參與多泡體生物發(fā)生的蛋白質(zhì)（Alix，TSG101），以及脂質(zhì)相關(guān)蛋白和磷脂酶。由于不同細(xì)胞來源的外泌體其蛋白質(zhì)有一定差異，目前最廣泛使用的“外泌體標(biāo)志物”包括四種跨膜蛋白（Alix，flotillin，TSG101 和 Rab5b）。 除了蛋白質(zhì)外，外泌體還富含脂質(zhì)，如膽固醇（主要是B淋巴細(xì)胞），神經(jīng)酰胺（與外來體分離溶酶體有關(guān)），以及具有長(zhǎng)飽和脂肪?；湹牧姿岣视王ィ?4，15］。Batista等［16］也發(fā)現(xiàn)外泌體表面富含甘露糖、聚乳糖胺、α-2，6唾液酸和復(fù)雜的N-連接聚糖等糖集團(tuán)。外泌體還含有細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)錄因子受體、生長(zhǎng)因子受體和其他生物活性分子。研究提示，信號(hào)通過三種方法從外泌體轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞：受體-配體相互作用，直接膜融合和內(nèi)吞作用/吞噬作用。迄今為止，分離外泌體多種方法可用，包括超速離心、蔗糖梯度超速離心結(jié)合超濾離心 （SGUUC）、磁性激活細(xì)胞分選（MACS）和商業(yè)試劑盒。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，可以使用不同的方法分離外泌體［17］。

2 外泌體在糖尿病腎病中的研究進(jìn)展

DN是終末期腎衰竭的主要原因，與其他導(dǎo)致腎病的原因相比，其與糖尿病發(fā)病率和病死率增加有關(guān)。白蛋白尿通常是DN的第一個(gè)臨床指標(biāo)。然而，微量白蛋白尿具有一定的局限性：首先，它不能用于DN的病因診斷，因?yàn)樗皇莾?nèi)皮損傷的標(biāo)志物；其次，它與腎臟損害的類型和數(shù)量無關(guān)；最后，它不是DN的必要條件：事實(shí)上，已知一些糖尿病患者在沒有出現(xiàn)白蛋白尿的情況下惡化為腎功能衰竭。除白蛋白之外的其他蛋白質(zhì)已確定為DN的診斷標(biāo)志物，如，β2微球蛋白（β2MG）和泛素。但這些蛋白質(zhì)也有局限性：β2MG是腎小管損傷的標(biāo)志物，直到現(xiàn)在還沒有研究比較糖尿病和非糖尿病腎病患者的尿β2MG排泄。泛素作為診斷標(biāo)志物也因?yàn)槟蛞核脚cDN組織學(xué)分類之間缺乏相關(guān)性而受到限制。白蛋白尿或蛋白尿是患有各種腎病的患者的常見癥狀，因此，仍作為診斷DN的特定生物標(biāo)志物。

尿液是腎臟疾病生物標(biāo)志物的理想來源，如尿液mRNA分析已作為發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)志物的工具。然而，尿中的mRNA通常來自凋亡或壞死細(xì)胞，很容易被尿RNase降解，幾乎沒有代表性的轉(zhuǎn)錄譜。但尿液中的外泌體攜帶的RNA可以傳遞到遠(yuǎn)處的靶細(xì)胞，是細(xì)胞間通訊的重要途徑，與尿游離RNA不同，外泌體核酸以明顯穩(wěn)定的形式存在，因?yàn)槭芪⑴荼Ｗo(hù)免受內(nèi)源性RNase活性的影響。此外，它們來自所有腎單位的活細(xì)胞，有可能為腎臟病理生理學(xué)提供有價(jià)值線索。Zubiri等［18］通過對(duì)DN和健康對(duì)照者的尿外泌體進(jìn)行差異定量分析，首次鑒定了352種與人類尿液外泌體相關(guān)的蛋白質(zhì)，并發(fā)現(xiàn)三種蛋白質(zhì)（AMBP，MLL3和 VDAC1）在 DN 中的變化，為改善DN的早期診斷、預(yù)測(cè)DN的進(jìn)展，以及監(jiān)測(cè)DN對(duì)治療的反應(yīng)開辟了一個(gè)新的研究領(lǐng)域。Jiang等［19］也提出了可將外泌體用于治療DN的研究，將人尿液干細(xì)胞中提取的外泌體（USCs-Exo）靜脈注射到Ⅰ型糖尿病大鼠，由于外泌體很少足細(xì)胞凋亡因而能改善Ⅰ型糖尿病大鼠的腎損傷，這可能與人尿液干細(xì)胞（USCs）中潛在的細(xì)胞因子VEGF、TGF-β1、血管生成素和BMP-7有關(guān)。USCs-Exo的應(yīng)用有望成為治療DN的新方法。當(dāng)然這需要進(jìn)一步研究關(guān)于足細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞外泌體作用的機(jī)制和途徑。

2.1 DN診斷方面外泌體WT1的水平與尿蛋白-肌酐比，白蛋白-肌酐比和血清肌酐的顯著增加以及eGFR的下降相關(guān)。此外，與尿液WT1陰性患者相比，WT1陽(yáng)性的患者腎功能降低。ROC曲線分析顯示W(wǎng)T-1能有效預(yù)測(cè)eGFR<60 ml/min·1.73 m2患者。WT1蛋白主要在糖尿病患者的尿外泌體中存在，而且其表達(dá)水平隨著腎功能的下降而增加，表明它可以用作糖尿病腎病的早期非侵入性標(biāo)志物［20］。最新研究［21］表明尿外泌體WT1可預(yù)測(cè)未來幾年eGFR的下降，因而可作為改善DN患者危險(xiǎn)分層的有用生物標(biāo)志物。Zubiri等［22］對(duì)大鼠尿外泌體分析發(fā)現(xiàn)，與健康動(dòng)物相比，糖尿病大鼠的尿外泌體中的Regucalcin蛋白減少，從而反映病理組織的變化，但這需要進(jìn)一步的前瞻性研究，評(píng)估疾病進(jìn)展和治療過程中regucalcin的水平變化，揭示regucalcin與白蛋白尿，eGFR和生物標(biāo)志物變化的相關(guān)性并評(píng)估regucalcin與其他傳統(tǒng)或新型生物標(biāo)志物相比或與之相結(jié)合的預(yù)測(cè)潛力，從而進(jìn)行更精確的疾病分期和治療的個(gè)體化?？傊?，DN腎組織中regucalcin蛋白表達(dá)明顯降低，在糖尿病腎病患者尿分離的外泌體中有所表現(xiàn)，故尿外泌體regucalcin可作為探索糖尿病腎病的早期診斷和進(jìn)展監(jiān)測(cè)的新工具。Mohan等［23］證實(shí)了在糖尿病進(jìn)展期糖尿病大鼠尿液外泌體中miR-451-5p和miR-16水平逐漸升高，但在糖尿病大鼠腎臟中均減少，腎組織miR-451-5p和miR-16表達(dá)（10周時(shí)）與尿液水平無相關(guān)性，與腎臟病理指標(biāo)呈負(fù)相關(guān)。從而提出糖尿病患者腎miR-451-5p和miR-16的相對(duì)升高對(duì)糖尿病引起的腎纖維化有保護(hù)作用，而UE miR-451-5p作為腎臟疾病的早期、敏感的非侵襲性指標(biāo)，可能具有預(yù)后價(jià)值，但有待進(jìn)一步研究確定miR-451-5p作為一種非侵入性工具連續(xù)監(jiān)測(cè)糖尿病腎損傷的潛力。 有研究［24，25］報(bào)道尿外泌體中 miR-29c 的水平可反映腎功能和組織學(xué)纖維化程度，而作為腎纖維化的新型非侵入性標(biāo)志物。Krishnamurthy等［26］通過連續(xù)離心將尿外來體與全尿分離，并通過ELISA測(cè)量血漿銅藍(lán)蛋白，發(fā)現(xiàn)糖尿病腎病患者的尿外泌體中明膠酶活性降低和血漿銅藍(lán)蛋白水平升高與腎組織中這兩種蛋白質(zhì)的改變一致，而全尿中這兩種蛋白質(zhì)的水平變化很大，并且與糖尿病腎組織中的表達(dá)水平無關(guān)，尿液外泌體中的蛋白質(zhì)標(biāo)志物比全尿樣本能更好地反映腎臟中潛在的蛋白質(zhì)變化，因此尿液外泌體用于糖尿病腎病的診斷和監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展似乎是一種有潛力的方法。最近［27］有人對(duì)健康對(duì)照、Ⅱ型糖尿病和Ⅱ型糖尿病腎病患者的尿液外泌體進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)Ⅱ型糖尿病腎病患者尿外泌體衍生的let-7c-5p在DN患者的尿外泌體中顯著上調(diào)（P<0.05），并且與腎小球?yàn)V過率（P<0.001）和DN的進(jìn)展相關(guān)，其預(yù)測(cè)DN的AUC為0.81，也可作為DN的一種潛在生物標(biāo)志物。

2.2 在糖尿病腎病機(jī)制研究方面腎纖維化是各種慢性腎病的標(biāo)志，TGF-β是腎纖維化的關(guān)鍵介質(zhì)［28］。腎小球內(nèi)皮細(xì)胞（GEC）和腎小球系膜細(xì)胞（GMC）之間的相互作用是糖尿病腎?。―N）的重要方面。研究證明，與正常葡萄糖（NG）處理的GEC相比，高糖（HG）處理的GEC分泌更多數(shù)量的高度富集 TGF-β1mRNA的外泌體，并通過 TGF-β1/Smad3信號(hào)傳導(dǎo)途徑促進(jìn)GMC中的α-平滑肌肌動(dòng)蛋白表達(dá)，細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白過量產(chǎn)生，從而促進(jìn)腎纖維化［29］。Delic 等［30］首次證明了Ⅱ型DN患者的尿外來體中miRNA譜的改變，他們使用qRT-PCR方法發(fā)現(xiàn)miRNA miR-320c和miR-6068在DN患者的尿外泌體中顯著上調(diào)，其中miRNA miR-320c通過靶向血小板反應(yīng)蛋白1（TSP-1）可能對(duì)TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)途徑產(chǎn)生影響從而促進(jìn)DN的病情進(jìn)展，并且上調(diào)的miR-320c可誘導(dǎo)BMP6的下調(diào)和TSP-4表達(dá)抑制，進(jìn)一步加速腎纖維化過程，為DN的病理機(jī)制提供了新的見解。Ebrahim等［31］進(jìn)行大鼠體外實(shí)驗(yàn)研究了外泌體對(duì)DN的腎保護(hù)機(jī)制，他們發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）衍生的外泌體可以抑制糖尿病大鼠腎臟體內(nèi)mTOR信號(hào)通路，加強(qiáng)自噬調(diào)節(jié)能力來改善腎功能，從而在糖尿病腎病進(jìn)程中起到保護(hù)腎臟的作用。 這些發(fā)現(xiàn)也為將來使用外泌體作為DN的新生物治療方法提供了基礎(chǔ)。

2.3 在糖尿病腎病治療方面Jiang等［19］提出了可將外泌體用于治療DN的研究。在Nagaishi等［32］的研究中認(rèn)為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌體攜帶的mRNA或miRNA在腎小管上皮細(xì)胞的保護(hù)和再生中起作用，其機(jī)制主要是通過抑制TEC中TGF-β過度表達(dá)和DN中管周上皮纖維化，從而保護(hù)腎小管上皮細(xì)胞免于凋亡，并保護(hù)緊密連接結(jié)構(gòu)，因此MSC-CM中包含的外泌體可能是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的治療效果的關(guān)鍵因素。最近Nagaishi等［33］也發(fā)現(xiàn)臍帶提取物含有富含外泌體，從臍帶提取物純化的外泌體可能是一系列細(xì)胞活化因子，可以增強(qiáng)糖尿病腎病患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖并改善其修復(fù)功能，以及抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激改善糖尿病腎損傷。預(yù)想，臍帶提取物或許可以提高骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞自體細(xì)胞移植的治療效果。

綜上所述，外泌體是一種存在于多種體液中，功能多樣且容易提取的小分子囊泡，在細(xì)胞間傳遞信息，是細(xì)胞間通訊的重要途徑，與糖尿病腎病的發(fā)生、診斷、預(yù)后密切相關(guān)，有希望成為檢測(cè)糖尿病腎病的新型標(biāo)志物，并且已有用于糖尿病腎病治療的研究。在糖尿病腎病診斷及治療中的機(jī)制仍須進(jìn)一步研究。