李峪鵬，許禎瑩，李娟，蘇志鵬，劉瀚揚(yáng)，朱佳文*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川 成都 611130；2.四川省成都市農(nóng)林科學(xué)院，四川 成都 611130；3.四川特驅(qū)投資集團(tuán)有限公司，四川 成都 610207）

近年來，有很多關(guān)于動(dòng)物腸道微生物菌群組成與其自身健康息息相關(guān)的報(bào)道。研究者們利用下一代測序工具（NGS）對(duì)腸道微生物菌群的組成進(jìn)行快速且精確的研究。16S rRNA分析技術(shù)是最常用來分析微生物多樣性的工具，它可以利用相關(guān)區(qū)域的變異性對(duì)菌群組成的差異性進(jìn)行分析。變性凝膠梯度電泳（PCR-DGGE）技術(shù)在16S rRNA技術(shù)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步對(duì)微生物多樣性進(jìn)行分析，其原理是利用相同大小DNA片段不同的堿基序列，讓DNA片段通過由低到高的變性梯度凝膠進(jìn)行電泳，當(dāng)DNA分子遷移到不同變性濃度的聚丙烯酰胺凝膠時(shí)，不同序列的DNA片段會(huì)停留在不同濃度的凝膠位置。

1 PCR-DGGE技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)

PCR-DGGE技術(shù)具有快速高效檢測突變DNA片段的優(yōu)點(diǎn)，并且重復(fù)性好，目前已在畜牧行業(yè)中廣泛應(yīng)用。在使用DGGE工具時(shí)，需要提取樣品的總DNA，并設(shè)計(jì)帶有CG的夾板引物，對(duì)DNA的可變區(qū)域（V1、V1-V3、V3、V4-V5、V3-V5、V6-V8a、V6-V8b、V8）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過DGGE指紋圖譜進(jìn)行特異性分析，建立系統(tǒng)發(fā)育樹，最終得到微生物菌群的差異性。雖然PCRDGGE技術(shù)比16S rRNA和ERIC-PCR略為復(fù)雜，但精確度更高、重復(fù)性更好。有學(xué)者分別利用ERIC-PCR和PCR-DGGE技術(shù)對(duì)喂服枯草芽孢桿菌的肉雞腸道菌群進(jìn)行研究，結(jié)果得出：雖然兩種方法檢測結(jié)果均顯示飼喂枯草芽孢桿菌能提高肉雞腸道微生物的豐度和種群密度[1]，但從指紋圖譜和統(tǒng)計(jì)條帶數(shù)量上來看，PCR-DGGE技術(shù)優(yōu)于ERIC-PCR技術(shù)[2]。然而PCR-DGGE技術(shù)仍然有著局限性：在DNA的保存與提取時(shí)，若方法不當(dāng)則會(huì)造成DNA降解，引起實(shí)驗(yàn)誤差；在研究復(fù)雜生態(tài)環(huán)境系統(tǒng)時(shí)，往往會(huì)有種類復(fù)雜的微生物組成，DGGE圖譜只有其中的優(yōu)勢菌群才會(huì)呈現(xiàn)出條帶，而含量低于1%以下的弱勢菌群不會(huì)被檢出；并且該方法依賴于基因數(shù)據(jù)庫，如果數(shù)據(jù)庫中序列信息不夠則也會(huì)受到限制。

2 PCR-DGGE技術(shù)的具體分析方法

2.1 糞便樣品保存 糞便樣品的保存方法直接影響DNA降解程度，而分子生物學(xué)分析的可信度依賴于DNA模板的降解程度。目前可靠的糞便保存方法包括低溫保存[3]、福爾馬林保存、硅珠保存、DETs保存、干燥保存、乙醇保存等[4]。在需要長時(shí)間保存DNA時(shí)，一般選擇乙醇保存法，可以在數(shù)月到數(shù)年內(nèi)保存較高質(zhì)量的DNA樣本，而在較短時(shí)間內(nèi)保存DNA，使用低溫保存法即有不錯(cuò)的效果[5]。

2.2 樣品中的DNA提取 采用市場上成熟的DNA提取試劑盒對(duì)動(dòng)物糞便樣品中的DNA進(jìn)行提取。提取到的DNA使用細(xì)菌16S rRNA基因通用引物27F和1492R對(duì)糞便樣品總DNA進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過一定比例稀釋作為模板，再用特異性引物（例如針對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因V3區(qū)域的特異片段進(jìn)行GC引物設(shè)計(jì)）進(jìn)行巢氏PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用于后續(xù)DGGE分析。

2.3 電泳分析 在變性劑梯度為40%～60%，電壓60 V和60 ℃條件下電泳14 h后，用相應(yīng)的核酸染料染色并用Quantity One等軟件進(jìn)行DGGE圖譜聚類分析。計(jì)算每個(gè)樣品中微生物的多樣性指數(shù)：豐度（S）、指數(shù)（H）和均勻度（E）。S為豐度，即每一條泳道的條帶數(shù)目，H和E的計(jì)算公式為：H＝∑PilnPi，Pi＝Ni∕N，Ni表示樣品上第i個(gè)條帶的吸收峰面積，N表示樣品中所有條帶吸收峰的總面積；E＝H∕lnS。從DGGE凝膠中選取明顯或優(yōu)勢條帶進(jìn)行割膠回收，并進(jìn)行測序分析。測得的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，用MEGA等軟件對(duì)序列進(jìn)行配比分析和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。

3 PCR-DGGE技術(shù)在分析動(dòng)物腸道微生物多樣性中的應(yīng)用

3.1 動(dòng)物腸道菌群多樣性分析的重要性 動(dòng)物腸道中棲息著的大量微生物在消化吸收、能量代謝、免疫調(diào)節(jié)、抗病能力等方面發(fā)揮著重要作用，正常情況下腸道菌群處于一個(gè)平衡狀態(tài)，對(duì)以上生理功能起著保護(hù)、促進(jìn)作用，但是當(dāng)菌群的數(shù)量、種類、比例等各方面失調(diào)時(shí)就會(huì)引起疾病，嚴(yán)重的會(huì)引起動(dòng)物死亡[6]。研究動(dòng)物腸道菌群多樣性，通過分析動(dòng)物腸道菌群的豐度以及結(jié)構(gòu)組成，進(jìn)一步了解動(dòng)物各種疾病病因、生長發(fā)育速度與腸道微生物之間的關(guān)系，從而為預(yù)防和治療腸道疾病提供合理的理論依據(jù)。目前已有微生態(tài)制劑開始應(yīng)用于預(yù)防和治療疾病，提高動(dòng)物生產(chǎn)性能等方面[7-8]。

3.2 應(yīng)用案例 Suchodolski等[9]分別從犬只十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸和直腸中收集腸道內(nèi)容物，通過PCR-DGGE技術(shù)評(píng)價(jià)了犬腸道內(nèi)不同區(qū)域和不同犬只間細(xì)菌菌群的差異，通過計(jì)算Simpson多樣性指數(shù)、Shannon-Weaver多樣性指數(shù)和均勻度來評(píng)價(jià)細(xì)菌的多樣性，結(jié)果表明，不同犬只腸道菌群的優(yōu)勢微生物不同，存在明顯的差異性。Lubbs等[10]利用PCR-DGGE技術(shù)檢測成年貓日常蛋白質(zhì)攝入量對(duì)胃腸道菌群變化的影響，發(fā)現(xiàn)高蛋白會(huì)引起微生物種群的急劇變化，在雙歧桿菌數(shù)量減少的高蛋白飲食中可以通過益生菌進(jìn)行調(diào)節(jié)。脫氧雪烯醇是一種霉菌毒素（DON），是很多國家面臨的食品安全問題，有學(xué)者通過PCR-DGGE技術(shù)利用常規(guī)微生物選擇策略，從雞腸道中分離出了脫氧雪蘭素轉(zhuǎn)化菌，大大提高了細(xì)菌選擇的效率。因此，采用PCR-DGGE技術(shù)引導(dǎo)腸道細(xì)菌轉(zhuǎn)化是一種高效的方法[11]。

Liu等[12]用PCR-DGGE和克隆文庫方法分別分析了中國對(duì)蝦腸道微生物的多樣性，得到了相似的結(jié)果，主要以弧菌為主，證明了兩種不同的分子生物技術(shù)在一定程度上具有代表性。2016年，馮方周等[13]采用PCR-DGGE技術(shù)研究雛雞大腸桿菌感染模型，發(fā)現(xiàn)隨著雛雞日齡增加，其腸道菌群多樣性也逐漸增加，腸球菌、大腸桿菌、葡萄球菌以及梭菌均有出現(xiàn)，在感染大腸桿菌后，圖譜條帶出現(xiàn)增加或缺失的現(xiàn)象，而噬菌體作用后的有些條帶日漸恢復(fù)正常。由于養(yǎng)鴨業(yè)的快速發(fā)展，大部分鴨群排泄物直接進(jìn)入到人類賴以生存的生活環(huán)境中，因此有學(xué)者利用PCR-DGGE技術(shù)分析鴨場水樣樣本中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，客觀地反映鴨場環(huán)境微生物多樣性的特點(diǎn)，為防治細(xì)菌性疾病提供理論依據(jù)[14]。

為了研究獺兔腹瀉后盲腸菌群結(jié)構(gòu)的變化情況，周毅等[15]應(yīng)用PCR-DGGE和Real-Time PCR分析健康獺兔與腹瀉獺兔盲腸菌落的差異性，發(fā)現(xiàn)獺兔腹瀉后盲腸有益微生物數(shù)量降低，有害微生物數(shù)量增加，但是菌群結(jié)構(gòu)差異不明顯。2018年，為研究海參花酶解物對(duì)小鼠腸道微生物的影響，有學(xué)者采用PCR-DGGE技術(shù)分析其微生物群落結(jié)構(gòu)及動(dòng)態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組樣品中擬桿菌門、變性菌門為小鼠腸道的優(yōu)勢菌群，隨著海參花酶解物濃度的增加，小鼠腸道菌群中的幽門螺旋桿菌屬含量降低，厚壁菌門乳酸桿菌屬含量增加，說明海參花酶解物對(duì)調(diào)節(jié)小鼠腸道菌群有一定的作用[16]。

4 小結(jié)

研究動(dòng)物腸道菌群是研究動(dòng)物營養(yǎng)水平的基礎(chǔ)，是現(xiàn)代畜牧業(yè)抗生素替代策略必不可少的途徑。腸道微生物多樣性受宿主環(huán)境變化的影響非常大，PCR-DGGE技術(shù)可以在16S rRNA技術(shù)基礎(chǔ)上進(jìn)一步對(duì)微生物多樣性進(jìn)行分析，并具有一定的優(yōu)勢，在追蹤腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)特征和監(jiān)測生物種群動(dòng)態(tài)中具有重要的作用，能更好地為人類了解和監(jiān)測動(dòng)物腸道微生物穩(wěn)態(tài)提供幫助。