盛 敏

(河南省動物疫病預(yù)防控制中心,河南鄭州 450000)

1 設(shè)施環(huán)境

當實驗室只做熒光PCR方法時，應(yīng)當設(shè)置以下區(qū)域：試劑準備室、核酸提取室、擴增分析室。試劑準備室用于貯存試劑的制備、試劑的分裝和擴增反應(yīng)體系的配制，以及離心管、Tip頭等消耗品的貯存和準備。核酸提取室用于樣品處理、核酸提取、貯存及其加入至擴增反應(yīng)管。樣品處理應(yīng)符合生物安全二級實驗室防護設(shè)備、個人防護和操作規(guī)范的要求。擴增分析室用于DNA擴增及檢測分析。這3個區(qū)域在物理空間上必須是完全相互獨立的，在使用中也始終處于完全的分隔狀態(tài)，不能有空氣直接相通。為防止擴增產(chǎn)物順空氣氣流進入擴增前的區(qū)域，造成污染，實驗室的空氣流向應(yīng)按照試劑準備室→核酸提取室→擴增分析室進行。按照從試劑準備室→核酸提取室→擴增分析室方向空氣壓力遞減的方式進行。可通過安裝排風(fēng)扇、負壓排風(fēng)裝置或其他可行的方式實現(xiàn)。

2 樣品

用于非洲豬瘟檢測的樣品是具有潛在傳染危險性的材料，進行剪碎、研磨、離心及滅活處理時應(yīng)在二級生物安全柜中進行，勿使液體濺到生物安全柜中，避免樣品間交叉污染。裝有樣品的離心管一定要蓋嚴，避免由于密封不嚴溢于容器外或容器外粘有樣品而造成相互間交叉污染。

3 儀器

在試驗中用到的主要儀器有熒光PCR 儀、冷凍離心機、二生物安全柜、核酸提取儀、微量移液器等，要對這些儀器定期進行檢定/校準或功能性檢查，確保儀器處于正常工作狀態(tài)。要保持熒光PCR 儀的清潔衛(wèi)生，避免儀器內(nèi)部被熒光物質(zhì)污染。試劑準備室和核酸提取室都要有一套完整移液器（覆蓋0.2～1000μl），互相不能調(diào)換使用。

4 試劑

使用市售商品化試劑盒的實驗室，在收到試劑盒后應(yīng)將盒內(nèi)的陽性對照放置于核酸提取室，將熒光PCR預(yù)混液放置于試劑準備室。試劑盒中的陽性對照大多是重組質(zhì)粒及高濃度陽性標本，在開蓋吸取的時候一定要小心，一旦濺灑，污染樣品的可能性很大。

5 人員

檢測人員要具備良好的防污染意識和操作技能，到不同的區(qū)域時，要注意及時更換防護用品。在核酸提取室操作時，戴的一次性手套、口罩、帽子要勤換，避免污染。要帶新的一次性PE手套對熒光 PCR管封蓋，避免徒手或用過的手套接觸熒光 PCR 管，檢測過程中使用不帶熒光物質(zhì)的一次性手套。為避免污染，實驗室在人員管理上要實行考核上崗和定期培訓(xùn)制度，檢測人員要培訓(xùn)考核合格后才能上崗。

6 試驗

6.1 基本原則

進入各工作區(qū)域應(yīng)當嚴格按照單一方向進行，即試劑準備室→核酸提取室→擴增分析室。各工作區(qū)域必須有明確的標記，不同工作區(qū)域內(nèi)的設(shè)備、物品不得混用。建議不同的工作區(qū)域使用不同的工作服（用顏色區(qū)分）。工作人員離開各工作區(qū)域時，不得將工作服帶出。實驗室的清潔應(yīng)當按試劑準備室→核酸提取室→擴增分析室的方向進行。不同的實驗區(qū)域應(yīng)當有其各自的清潔用具以防止交叉污染。

6.2 預(yù)混和分裝試劑

擴增所需要的試劑均應(yīng)在裝有紫外燈的超凈工作臺或負壓工作臺配制和分裝。一般會將熒光PCR預(yù)混液小量分裝，-20℃保存。以減少重復(fù)加樣次數(shù)，避免污染機會。預(yù)混和分裝試劑時只能用試劑準備室的移液器和 Tip頭，禁止用其他區(qū)域的移液器和Tip頭。

6.3 核酸提取加樣

要認真按照試劑盒說明書或作業(yè)指導(dǎo)書步驟進行，防止試劑和樣品受到氣溶膠的污染。操作時要戴一次性手套，若不小心濺上反應(yīng)液，應(yīng)立即更換手套。開離心管時要用雙手，動作要輕緩，防止液體濺出[1]。若不小心濺到手套或桌面上，應(yīng)立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面。用移液器吸取液體或加樣時要十分小心，吸取要慢，吸取時盡量一次性完成，不要多次抽吸，如果有條件，可使用帶濾芯的Tip頭，以免交叉污染或產(chǎn)生氣溶膠污染。加樣時最后加陽性對照，減少陰性對照和樣品被污染的概率。為避免樣品間的交叉污染，加入待測核酸后，應(yīng)立刻蓋緊管蓋。

6.4 擴增分析

在擴增分析室要盡量減少走動，以避免氣溶膠所致的污染。因為熒光PCR擴增后不需要電泳，擴增后的反應(yīng)管嚴禁打開，直接進行無害化處理。

6.5 清潔

試驗結(jié)束后，必須立即對工作區(qū)進行清潔。通常采用次氯酸鈉或紫外照射對工作區(qū)的實驗臺表面進行消毒清潔。次氯酸鈉具有氧化損傷核酸的作用，從而使可能留在實驗臺面核酸被破壞掉。通常使用10%的次氯酸鈉擦洗實驗室，然后再用70%乙醇或清水洗去次氯酸鈉。紫外照射非常方便有效，其去污效果取決于紫外照射的距離和能量。一般將可移動紫外燈（254nm波長）調(diào)至實驗臺上60～90cm內(nèi)照射。由于熒光PCR擴增產(chǎn)物僅幾百或幾十堿基對，對紫外線損傷敏感度低，因此最好是照射過夜。